[發明專利]一種細胞膜蛋白質富集純化方法

有效

• 申請號: 201310557138.7
• 申請日: 2013-11-08
• 公開（公告）號: CN104628810B
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 張麗華;方菲;趙群;隨志剛;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：使用功能化磁性微球捕獲作為誘餌的細胞膜表面糖基化修飾蛋白，以富集及分析細胞膜蛋白質，具體包括：

（1）將培養皿中孵育的細胞樣品消化后，向細胞樣品中加入由氧化緩沖液配制的氧化劑溶液與細胞進行反應；

（2）氧化反應結束后，采用氧化緩沖液清洗步驟（1）中細胞樣品；

（3）向細胞樣品中加入懸浮于氧化緩沖液的帶有功能化官能團的磁性微球，室溫下震蕩2-24h；

（4）采用三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗步驟（3）中捕獲細胞樣品的磁性微球；

（5）將步驟（4）中捕獲細胞樣品的磁性微球重懸浮于三羥甲基氨基甲烷緩沖液，室溫下孵育5min-2h；

（6）使用鹽溶液清洗步驟（5）中細胞樣品；

（7）對步驟（6）中經清洗的細胞樣品進行裂解；

（8）使用鹽溶液清洗步驟（7）中經裂解的細胞樣品；

（9）使用酶解或溶劑萃取的方法獲得磁性微球上富集的細胞膜蛋白質，得所需細胞膜蛋白樣品溶液。

2.按照權利要求1所述細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：步驟（1）和（2）中所述的氧化緩沖液為醋酸鹽和氯化鹽混合緩沖液或磷酸緩沖液，醋酸鹽和氯化鹽混合緩沖液中醋酸鹽和氯化鹽濃度分別為10-200mM，氧化緩沖液pH范圍為4-7；

步驟（1）中所述的氧化劑為高碘化物；氧化劑濃度為1-100mM；氧化反應時間為5min-2h。

3.按照權利要求1所述細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：步驟（1）中所述的細胞樣品消化方法包括酶消化法、離子螯合法或物理法。

4.按照權利要求1所述細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：步驟（3）中所述的功能化磁性微球為以四氧化三鐵/二氧化硅復合納米磁球為核，使用帶酰肼或氨基官能基團的硅烷化試劑制備的磁性微球。

5.按照權利要求1所述細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：步驟（4）和（5）中所述的三羥甲基氨基甲烷緩沖液濃度為20mM-1M；pH為7-10。

6.按照權利要求1所述細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：步驟（6）和步驟（8）中所述的鹽溶液可為濃度為0.1-8M的氯化鈉溶液、0.1-8M的氯化鉀溶液、0.1-1M的碳酸鈉溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的鹽酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氫銨溶液。

7.按照權利要求1所述細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：步驟（7）中所述的細胞裂解方法包括機械裂解、化學裂解或酶裂解。

8.按照權利要7中所述細胞裂解方法，其特征在于：若采用機械裂解或化學裂解方法進行細胞裂解，在細胞裂解過程中需加入蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑為下列物質中一種或二種以上組成的混合物：AEBSF、Aprotinin、Bestatin、Sodium Pyrophosphate、E-64、EDTA、Leupeptin、Pepstatin A、PMSF，上述物質濃度范圍分別在1-200mg/mL之間。

9.按照權利要求1所述細胞膜蛋白質富集純化方法，其特征在于：步驟（9）中所述的磁性微球上膜蛋白質獲取方法如下：

若采取酶解方法，向細胞樣品中加入pH為7.5-14的堿性緩沖溶液配制的糖基肽酶溶液，反應6-24h使連接在磁性微球上的糖鏈斷裂以獲得磁性微球上細胞膜蛋白質溶液；所述的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液，可為碳酸氫銨緩沖鹽溶液、磷酸緩沖鹽溶液或三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液；

若采取溶劑萃取的方法，向細胞樣品中加入溶有體積濃度為1%-30%的表面活性劑或去垢劑的pH為7.5-14的堿性緩沖溶液，超聲萃取0.1-2h獲得磁性微球上細胞膜蛋白質溶液；所述的表面活性劑包括十二烷基磺酸鈉、脫氧膽酸鈉、Triton X-100、chaps、Rapigest SF或NP-40d；去垢劑包括尿素、硫脲或鹽酸胍。