[發明專利]亨廷頓蛋白的糖基化修飾方法

有效

• 申請號: 201310555234.8
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103601797A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 王喆明
• 申請（專利權）人: 杭州拜善晟生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/107;C12N15/70
• 代理公司: 杭州華知專利事務所 33235
• 代理人: 張德寶

技術領域

本發明涉及一種蛋白質的化學修飾，具體涉及一種亨廷頓蛋白的糖基化修飾方法。

背景技術

蛋白質修飾是一個復雜的過程，在真核生物中修飾類型很多，常見的有糖基化、乙酰化、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白質修飾能夠改變蛋白質的活性、定位或功能。蛋白糖基化對蛋白質的功能和穩定性有重要的影響，首先許多的錯誤折疊蛋白，對細胞活動和組織代謝產生一定影響，進而影響到器官的功能，糖基化蛋白的連接形式主要有N、O連接兩種形式。蛋白結構的改變對圓二色譜吸收和抗水解酶能力有一定的影響；其次，一些糖基化蛋白有利于蛋白質的正確折疊.

亨廷頓舞蹈病(Huntington?disease，HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經變性疾病，?HD基因編碼一個由3144個氨基酸組成的亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)，從Htt氨基酸末端第17位開始有一段重復的谷氨酰胺(CAG)序列。CAG重復序列將產生兩個直接結果：一是使野生型亨廷頓蛋白(wild?huntingtin，wHtt)缺失，二是產生突變型亨廷頓蛋白(mutant?Htt，mHtt)。隨著多聚谷氨酰胺的過度延長，Htt蛋白會在轉谷氨酰胺酶的作用下發生交聯而形成聚集體，在主鏈和側鏈酰胺基之間氫鍵連接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，稱為多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ長度小于35個，而HD患者的PolyQ長度會超過37個。這些異常蛋白質積聚成塊，損壞部分腦細胞，特別是那些與肌肉控制有關的細胞，導致患者神經系統逐漸退化，神經沖動彌散，動作失調，出現不可控制的顫搐，并能發展成癡呆，甚至死亡。臨床表現主要為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進行性癡呆。

沒有修飾的亨廷頓蛋白顯示出穩定性較差等，目前國內還沒有研究所或者機構對亨廷頓蛋白進行化學修飾。通過對亨廷頓蛋白的糖基化修飾，主要是Ser和Thr的O-連接糖基化，顯示出蛋白的穩定性增加，糖基化蛋白有不同的圓二色譜吸收，顯示出糖基化蛋白有較強的穩定性，且溫度和時間對亨廷頓蛋白的吸收峰的影響，說明經糖基化修飾的亨廷頓蛋白相對穩定，因此研究亨廷頓蛋白的糖基化對亨廷頓疾病的治療有重要意義。

發明內容

針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種亨廷頓蛋白的糖基化修飾方法，通過對亨廷頓蛋白的糖基化修飾，主要是Ser和Thr的O-連接糖基化，顯示出蛋白的穩定性增加，糖基化蛋白有不同的圓二色譜吸收，顯示出糖基化蛋白有較強的穩定性，且溫度和時間對亨廷頓蛋白的吸收峰的影響，說明經糖基化修飾的亨廷頓蛋白相對穩定，因此研究亨廷頓蛋白的糖基化對亨廷頓疾病的治療有重要意義。

本發明的目的可通過下列技術方案來實現：一種亨廷頓蛋白的糖基化修飾方法，包括以下步驟：（1）、獲取重組蛋白Htt（1-90）：a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達質粒pTWIN1-htt的構建；c、表達亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5α-htt的構建；d、重組蛋白的表達；（2）、重組蛋白Htt（1-90）的純化；（3）、SPPS方法獲得糖基化修飾的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的純化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽與重組蛋白Htt（1-90）經過偶聯獲得經糖基化修飾目的蛋白Htt（1-158）；（6）經糖基化修飾目的蛋白Htt（1-158）的純化。