[發明專利]一種同時檢測四種腫瘤標志物的化學發光試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201310553615.2
• 申請日: 2013-11-08
• 公開（公告）號: CN103558384A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 章登吉;程禹;段新偉;張波
• 申請（專利權）人: 點亮生物科技無錫有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N21/76
• 代理公司: 上海君鐵泰知識產權代理事務所(普通合伙) 31274
• 代理人: 潘建玲

技術領域

本發明涉及免疫檢測技術領域，特別涉及一種同時檢測四種腫瘤標志物的化學發光試劑盒及其制備方法。

背景技術

近年來，越來越多的證據證明了炎癥反應在抑郁癥疾病發生、發展過程中的作用，很多的炎性因子和相應的可溶性受體、趨化分子、粘附分子、急性期蛋白等會在抑郁癥患者的外周血、腦脊液中顯著上升，抑郁癥的個別癥狀如疲勞、認知障礙及睡眠障礙等與炎性因子之間的關系也被不斷報道。這些抑郁癥相關的生物標志物可以用于輔助臨床診斷及預后評價，將為抑郁癥的客觀診斷提供生物學證據。進一步經過我們應用600多份血清樣本對文獻報道的抑郁癥相關因子進行了大樣本量篩選驗證，初步確定了腦源性神經營養因子、皮質醇、表皮生長因子、髓過氧化物酶、催乳素、抵抗素、可溶性腫瘤壞死因子α受體II型作為抑郁癥輔助診斷的生物標志物。

目前市場上有很多檢測相關因子的傳統的單項ELISA技術，其成熟度高,特異性好,操作簡便。但通常的酶聯免疫吸附ELISA檢測樣本時，每個檢測孔一般需要100-200μl，樣本用量較大,另外抑郁癥的生物標志物不止一個，需要多個因子的聯合監測來進行診斷，在這樣的情況下若仍依賴于單項ELISA檢測，則樣本用量過大；對每個因子單獨檢測來輔助抑郁癥的診斷顯然費時費力，且診斷成本高昂，患者一般難以承受。

放射免疫分析方法RIA技術，它既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，但存在放射線輻射和污染等問題，而且對檢測人員的健康也構成威脅，并且，操作相對于ELISA復雜，一次檢驗只能測一個指標，還需要提供專門的放射性實驗場所，投資高，危害大。

蛋白芯片雖然能實現多個因子同時檢測的功能，但由于它是把抗體包被在用于制備蛋白質芯片的基底玻片、微球或膜上，并且基底玻片和膜在使用前要經過醛基化或多聚賴氨酸等預處理，導致生產成本增加，并且后續實驗操作繁瑣,，重復性差，難于推廣。

因此，免疫檢測技術領域急需一種工藝簡單，便于操作的，靈敏度高，能同時檢測四種腫瘤標志物的化學發光試劑盒及其制備方法。

發明內容

本發明提供了一種同時檢測四種腫瘤標志物的化學發光試劑盒及其制備方法，技術方案如下：

一種同時檢測四種腫瘤標志物的化學發光試劑盒，其特征在于，包括：

經過鍍膜處理的SA-HRP試劑盒，并且該SA-HRP試劑盒內含有用腦源性神經營養因子BDNF、表皮生長因子EGF、髓過氧化物酶MPO、和催乳素Prolactin四種抗原標被的以圓形陣列排布的酶標板、聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂Tween20和牛血清白蛋白BSA抗體、稀釋液、一份陽性血清對照樣本、一份陰性血清對照樣本、洗滌劑、處理酶、發光液。

一種同時檢測四種腫瘤標志物的化學發光試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步，制備抗體包被；

將0.1-20ng的腦源性神經營養因子BDNF、表皮生長因子EGF、髓過氧化物酶MPO、和催乳素Prolactin分別加入0.01-0.1mol/l的磷酸鹽緩沖溶液中；

進一步地，用全自動點樣儀提取10-100nl的上述含有四種特異性因子的磷酸鹽緩沖溶液，點樣于用等離子處理過的ELISA板的孔中；

進一步地，將點樣好的ELISA板置于2-8℃的溫度下包被16-24小時；

第二步，對第一步中ELISA板分別進行澆注、封閉、洗滌、晾干后，再保存起來待用；

首先，向PH值為7.4±0.2的磷酸鹽緩沖液中，依次加入0-0.05%的聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂Tween20和3%的牛血清白蛋白BSA，攪拌均勻后，向第一步中的ELISA板中澆注；向PH值為7.4±0.2的磷酸鹽緩沖液中，依次加入0-0.05%的聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂Tween20和5-10%的脫脂奶粉，攪拌均勻后，向第一步中的ELISA板中澆注；

進一步地，將該澆注好的ELISA板放在2-8℃的溫度下封閉放置16-24小時或者放在37℃下封閉放置2±0.5小時，或者室溫封閉3±0.5小時；

進一步地，用含有非離子型表面活性劑Tween20的PBS溶液對封閉好的ELISA板進行洗滌、晾干后，置于2-8℃的溫度下保存待用；

第三步，上樣，并將ELISA板放入孵育振蕩器中孵育抗體；

首先，取多份病人的血清樣本、1份經篩查過的正常人的陰性對照樣本和1份陽性對照樣本；