[發明專利]一種提取淡水魚背側肌肌球蛋白的方法

無效

• 申請號: 201310550300.2
• 申請日: 2013-11-08
• 公開（公告）號: CN103554243A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 彭增起;李君珂;徐萌;張雅瑋;王復龍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C07K1/30
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 程化銘

技術領域

本發明涉及一種提取淡水魚背側肌肌球蛋白的方法，尤其涉及一種提取淡水魚背側肌肌球蛋白時消除組織蛋白酶L影響的方法，屬于水產品技術領域。

背景技術

肌球蛋白是魚肉中含量最高也是食品加工中最重要的蛋白質，約占魚肉總蛋白質的三分之一，占肌原纖維蛋白的55%～60%。肌球蛋白可形成具有立體網絡結構的熱誘導凝膠和高壓誘導凝膠。肌球蛋白形成熱誘導凝膠是非常重要的工藝特性，直接影響魚糜類制品的質地、保水性和感官品質等。

溶酶體中存在多種組織蛋白酶，目前已從魚貝類肌肉和內臟中純化并鑒定出10種組織蛋白酶，即組織蛋白酶A、B、C、D、E、H、L、L-like及X。溶酶體組織蛋白酶L屬于木瓜蛋白酶超家族，具有內肽酶活，是溶酶體型半胱氨酸蛋白內肽酶。

魚肉肌肉內源組織蛋白酶L活性高，組織蛋白酶L的性質與魚糜制品品質密切相關，組織蛋白酶L分子質量24ku，最適于在pH3.0～6.5環境下降解肌球蛋白。有的組織蛋白酶與肌原纖維緊密結合，僅漂洗難以洗脫魚肉組織蛋白酶L，而其他組織蛋白酶可以從肌原纖維蛋白上洗脫下來。低pH值范圍內發生的蛋白質自溶主要是由組織蛋白酶L引起的，導致凝膠形成能力差，直接影響魚糜品質。

目前提取淡水魚背側肌肌球蛋白時的前處理通常是將魚肉直接采肉、切丁、于冰水溶液中漂洗，再進行勻漿、提取肌球蛋白。而組織蛋白酶L主要存在于魚肉的肝臟、溶酶體和血液中，低pH值和高溫會促進溶酶體的破裂，而使溶酶體中的組織蛋白酶L釋放出來，與肌球蛋白接觸并使其降解。提取肌球蛋白時通常是直接采肉，就可以避免肝臟中組織蛋白酶L對肌球蛋白的影響，根據弱堿性和低溫協同作用使溶酶體穩定來減少組織蛋白酶L的活性；對于血液中的組織蛋白酶L，通過快速漂洗魚肉來減少組織蛋白酶L的活性。

發明內容

本發明的目的是提供一種提取淡水魚背側肌肌球蛋白的方法，使用該方法可以有效減小提取淡水魚背側肌肌球蛋白時組織蛋白酶L的活性，提高肌球蛋白的濃度。

本發明解決其技術問題所采用的方法包括如下步驟：

（1）活魚放入周轉箱內靜置1～2?h，周轉箱中注入干凈新鮮的自來水，注水量以沒過魚體為準，并不斷向周轉箱中充入氧氣；

（2）?將活魚放在工作臺上，從活魚頭背連接處開刀快速采取背側肌，馬上將采好的背側肌置于冰水比w/v?=1:5的冰水中漂洗10～20s，隨即將魚塊撈出切成1～5cm×1～5cm×1～5cm魚肉丁，此步驟時間控制在1?min?之內；

（3）?將魚肉丁置于干凈濾網上，馬上用冰水比w/v=1:5的冰水沖洗1～1.5?min；

（4）?魚肉丁于5～8倍、溫度為0～4℃、pH值為7.2～7.6、20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液中漂洗10～20?min；

（5）將魚肉丁組織搗碎，放在10倍體積的緩沖溶液?A中漂洗20?min，1000×g離心5-15min；取出沉淀，放在沉淀5倍體積的緩沖溶液?B中懸浮，加ATP至終濃度為10mmol/L，2-6℃下放置0.5-1.5h，15000×g離心5-15?min；上清液用5倍體積1Mmol?KHCO₃溶液稀釋，放置10-20min,12000×g?離心5-15min；沉淀于5倍體積緩沖溶液?C中勻漿，放置5-15min；再用3倍體積1mmol/LKHCO₃溶液稀釋，添加無水MgCl₂至濃度為10mmol/L，2-6℃下放置8-12h；25000×g離心15-25min；沉淀物用2倍體積的緩沖溶液?C溶解，得到肌球蛋白溶液；制備好的肌球蛋白溶液置于2-6℃溫度下；

（6）測定肌球蛋白溶液組織蛋白酶L的活性和肌球蛋白溶液的濃度。

所述步驟（5）中緩沖溶液A為0.1M?KCl、1mM?PMSF和0.02%?NaN₃的20mM?Tris-HCl?緩沖液，pH為7.5。

所述步驟（5）中緩沖溶液B為0.45M?KCl、5mM?β-巰基乙醇、0.2?M?醋酸鎂、1mM?乙二醇-雙-（2-氨基乙基）四乙酸的20mM?Tris-HCl?緩沖液，pH為6.8。

所述步驟（5）中緩沖溶液C為0.5M?KCl、5mM?β-巰基乙醇的20mM?Tris-HCl?緩沖液，pH為7.5。

所述步驟（1）-（5）的環境溫度控制在10℃以下。

本發明的有益效果：