[發明專利]一種獲得高純高效的藻毒素降解酶的生物合成方法

有效

• 申請號: 201310546005.X
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN103555696A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 馮玲玲;萬堅;李俊;吳迪;蘇佳麗;任彥亮;肖閃
• 申請（專利權）人: 華中師范大學
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52;C12R1/19
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種獲得高純高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）將如SEQ?ID?NO.1所示的MlrA序列構建到原核表達載體pMAL-C2X上得到表達MlrA的載體pMAL-MlrA；

（2）將pMAL-MlrA轉化到大腸桿菌TB1中得到MlrA的表達菌；

（3）將MlrA的表達菌用IPTG誘導表達，收集誘導表達后的菌體，破碎后利用pMAL-C2X上的融合蛋白表達標簽純化得到高純高效的藻毒素降解酶。

2.根據權利要求1所述的獲得高純高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于：

步驟（1）中所述的載體pMAL-MlrA通過如下步驟的方法的制備：將如SEQ?ID?NO.1所示的MlrA通過合成載入克隆載體pUC19中，獲得pUC19-MlrA；以pUC19-MlrA為模板，用MlrA上游引物和下游引物擴增MlrA；通過上下游引物上的酶切位點BamH?I和Hind?III將MlrA構建到pMAL-C2X載體上，得到表達MlrA的載體pMAL-MlrA；

其中，MlrA上游引物為5’-GCGGATCCATGCGGGAGTTTGTCAAACAG-3’，MlrA下游引物為5’-CGCAAGCTTTCACGCGTTCGCGCCGGACTT-3’。

3.根據權利要求1所述的獲得高純高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于：

步驟（3）中所述的誘導條件為：誘導前菌液OD600為1.0，IPTG濃度為0.5mM，誘導表達溫度為22℃，誘導時間為8小時。

4.根據權利要求1所述的獲得高純高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于：

步驟（3）中所述的純化的方法包括如下步驟：用二次蒸餾水、0.5M的NaOH溶液、柱平衡緩沖液洗滌MBP柱，平衡純化柱；將收集的誘導表達后的菌體用柱平衡緩沖液重懸，超聲破碎，離心取上清，與平衡后的MBP樹脂結合；將結合的混合液倒入到空柱中，先用柱平衡緩沖液沖洗使雜蛋白從樹脂上脫落下來，再用洗脫緩沖液洗脫收集目的蛋白得到純化的藻毒素降解酶MlrA；其中，柱平衡緩沖液組分為：36mM?KH₂PO₄，18mM?K₂HPO₄，200mM?KCl；洗脫緩沖液組分為：0.36g麥芽糖，柱平衡緩沖液100mL。