[發(fā)明專利]一種檢測線粒體基因1555位A-G與1494位C-T突變的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310540246.3
• 申請日: 2013-11-05
• 公開（公告）號: CN103540676A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林文津;郭舜民;徐榕青;張亞敏
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外核酸檢測領(lǐng)域，采用PCR結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)，用于檢測患者血液DNA中線粒體基因突變，具體涉及檢測線粒體基因1555位A-G與1494位C-T突變的試劑盒。

背景技術(shù)

線粒體12SrRNA基因是氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致的非綜合征型聽力損失的一個突變熱點(diǎn)區(qū)域。由于A1555G和C1494T突變在12SrRNA基因形成G-C和U-A配對使得與氨基糖苷類抗生素的結(jié)合更加容易，這就是為何攜帶這些突變的人在接觸了氨基糖苷類抗生素時會出現(xiàn)或加重耳聾的原因。因此對這兩個點(diǎn)突變的檢測，對于預(yù)防氨基糖苷類抗生素中毒性耳聾有著重要的臨床意義。目前關(guān)于線粒體耳聾基因的檢測方法有多種，文獻(xiàn)已報道的方法有：酶切法、直接測序法、基因芯片法、實(shí)時熒光定量Taqman探針法等。檢測的突變熱點(diǎn)主要是1555、1494、961等。

目前這些方法只能定性檢測是否有基因突變，而且只能檢測出突變細(xì)胞比率在10%-20%以上的外周血，相比于傳統(tǒng)測序等方法，焦磷酸測序靈敏度更高，成本更低，不僅可以定性檢測是否有基因突變，而且可以獲得突變的比例。

焦磷酸測序技術(shù)是一種基于聚合原理的DNA測序方法，是新一代DNA序列分析技術(shù)。它是有4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（PPi）。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由Pyrogram?轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達(dá)到測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術(shù)產(chǎn)品具備同時對大量樣品進(jìn)行測序分析的能力，為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性研究和臨床檢驗(yàn)提供了非常理想的技術(shù)操作平臺。

目前市場上還沒有利用焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行線粒體基因突變檢測的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測線粒體基因1555位A-G與1494位C-T突變的試劑盒，是具有特異性高、成本低、定量、準(zhǔn)確檢測線粒體基因突變的試劑盒。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種檢測線粒體基因1555位A-G與1494位C-T突變的試劑盒包括含有SEQ?ID?NO.1所示的正向擴(kuò)增引物、SEQ?ID?NO.2所示的反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液，SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示的測序引物1和測序引物2。

正向擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO.1：5’-GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3’（mtDNA?nt1463-1482）。

反向擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO.2：5’-biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’?(mtDNA?nt1673-1692)。

測序引物1?SEQ?ID?NO.3：5’-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3’?（mtDNA?nt1464-1483）。

測序引物2?SEQ?ID?NO.4：5’-TACGCATTTATATAGAGGAG-3’?（mtDNA?nt1535-1554）。

所述試劑盒中含有空白對照品，所述空白對照品為水。

試劑盒含有A1555G與C1494T突變的陽性對照品。

測序引物1的序列與正向擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO.1相同。

所述的PCR反應(yīng)液中其他組分為常規(guī)的10×PCR?Buffer、dNTPs和H₂O，各組分按常規(guī)體積比配制：10×PCR?Buffer、dNTPs和H₂O和反應(yīng)液中引物的體積比為5∶3∶36∶1。

試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，其中包含有DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5’-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶，Taq聚合酶。

其中，反向擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO.2的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。正向擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO.1在純度較好的情況下，也可以替代測序引物1使用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明提供的一種檢測線粒體基因突變的焦磷酸測序試劑盒，定性、定量準(zhǔn)確，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機(jī)反應(yīng)，直接給出檢測位點(diǎn)的頻率分析，結(jié)果直觀。