[發(fā)明專利]一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310527117.0
• 申請日: 2013-10-30
• 公開（公告）號: CN103575907A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉苗苗;鄭益煒;王秉
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 魯秦

1.一種古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測方法，其特征在于利用夾心酶聯(lián)免疫方法來檢測古代膠結(jié)劑文物材料中的卵蛋白成分，即將Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體結(jié)合到聚苯乙烯固相載體表面形成固相抗體，然后和膠結(jié)劑文物洗脫液結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體，其與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物；加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)，因此可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的古代膠結(jié)劑文物材料中卵蛋白的檢測方法，其特征在于步驟如下：

a)溶液配制：PBS緩沖溶液的配制：KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，NaCl8.0g，NaH₂PO₄·7H₂O2.16g,用去離子水溶解并定容1000mL，調(diào)節(jié)PH至7.4,121℃滅菌處理；洗脫液的配制：5mL1mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液、1mL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸鈉(50mL去離子水中含有10g溶質(zhì))，加去離子水溶解并定容500mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，無菌抽濾后在室溫下儲存；

b)將PBS緩沖溶液80-100μL設(shè)為空白對照，樣品卵蛋白0.1-0.5mg設(shè)為陽性對照；將80-100μL的PBS緩沖溶液、0.1-0.5mg樣品卵蛋白、0.1-0.5mg的文物材料分別溶于80-120μL的洗脫液中，室溫下放置2-4天，形成陽性對照樣品卵蛋白洗脫液、實(shí)驗樣品文物材料洗脫液；

c)取包被液稀釋10000-12000倍的一抗即Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗體80-100μL，加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中，用保鮮膜封板，溫度4℃下保持24h，次日用PBS緩沖溶液充分洗滌3次，甩干；

d)各孔內(nèi)加入1%牛血清白蛋白（BSA）溶液100μL，封閉1h，然后用PBS緩沖溶液進(jìn)行洗滌三次，每次三分鐘；

e)各孔內(nèi)加入40μL-70μL的步驟b的陽性對照樣品卵蛋白樣品洗脫液和實(shí)驗樣品文物材料洗脫液，置37℃溫箱中一個小時，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，甩干；

f)各孔內(nèi)加稀釋10000-12000倍之間的酶標(biāo)二抗即堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)80-100μL，置37℃的烘箱中一個小時，移去液體，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次三分鐘，并甩干；

g)各孔內(nèi)加底物液1%的四甲基聯(lián)苯胺溶液100μL，置黑暗處使其反應(yīng)20min；

h)各孔內(nèi)加2mol/L?H₂SO₄溶液0.05mL，終止反應(yīng)；

i)將步驟h液體取出，加到酶標(biāo)儀中，讀取在450nm處的吸光度；

j)比較空白對照樣品卵蛋白和實(shí)驗樣品文物材料二者的吸光度數(shù)值OD；與空白對照樣品卵蛋白檢測的OD值相比，如果文物洗脫液中卵蛋白檢測實(shí)驗OD值明顯增加，證明實(shí)驗樣品文物材料中確實(shí)存在卵蛋白；與空白對照樣品卵蛋白檢測的OD值相比，如果文物洗脫液中卵蛋白檢測實(shí)驗OD值無顯著變化，證明實(shí)驗樣品文物材料中不存在卵蛋白。