[發明專利]一種重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法

有效

• 申請號: 201310526205.9
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103592441A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 王明麗;趙俊;關鑫
• 申請（專利權）人: 王明麗;趙俊
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術領域

本發明涉及重組豬干擾素ɑ的檢測，具體是一種重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，供實驗室和市場上對重組豬干擾素ɑ產品的鑒定和驗證用。

背景技術

豬干擾素在畜牧業生產上的應用已受到高度關注。最早在國內應用于獸醫臨床的是豬白細胞干擾素，由于這種干擾素存在工藝成本高等問題。而基因工程技術的發展為豬干擾素大量生產提供了新的平臺。我室采用基因工程技術獲得了一種重組豬干擾素ɑ（重組豬α干擾素的制備方法，專利號2008100201804），臨床試用結果表明其可有效治療豬病毒性腹瀉等疾病。但目前市場上尚無重組豬干擾素ɑ產品的檢測試劑盒，阻礙了其廣泛應用，因此有必要研制重組豬干擾素ɑ相應檢測試劑盒，確立檢測方法，供實驗室和市場上對重組豬干擾素ɑ產品的鑒定和驗證用。

膠體金免疫層析技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。它是繼傳統三大免疫標記技術之后又一較為成熟的、得到廣泛應用的免疫標記技術。當待測樣品加入到樣品膜上后，由于微孔濾膜的毛細管作用，使抗原抗體反應在固相膜上快速進行，檢測一般只要5～10?min?就會出結果,相比其它方法（如ELISA?需1～2?h）大大的縮短了檢測時間。其測試結果以肉眼可見的顯色條帶來判斷，不需要特別儀器設備，只需要試紙條或滲濾試劑盒，樣品只要做非常簡單的處理或不需要做前處理。且具有成本較低、操作簡單、試劑穩定不受溫度等外界因素影響、方便快捷、特異敏感、穩定性強、結果判斷直觀等優點，因而特別適合于現場快速檢查，具有巨大的發展潛力和廣闊的應用前景，代表了診斷試劑簡單快速、便于普及的發展方向。本發明制備了一種重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條。

發明內容

本發明目的就是為提供一種重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種重組豬干擾素ɑ雙抗體夾心法免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，包括以下步驟：

（1）純化抗重組豬干擾素ɑ單克隆抗體的制備：小鼠腹腔內注射0.5?ml液體石蠟，第7?d后每只小鼠腹腔注射1×10⁷/ml抗重組豬干擾素ɑ雜交瘤細胞懸液0.5?ml，7~10?d后觀察小鼠腹部膨脹程度收集腹水，經離心去沉淀后以辛酸-飽和硫酸銨粗純，再以DEAE陰離子交換層析進一步純化抗重組豬干擾素ɑ單克隆抗體，?-80℃保存；

（2）膠體金的制備：采用檸檬酸三鈉還原法制備40?nm膠體金，取0.01％?HAuCl₄?水溶液100?ml，加熱煮沸，迅速加入1％檸檬酸三鈉水溶液1ml，繼續煮沸約5?min，制成粒徑40?nm?金顆粒，此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸三鈉加入后很快變成灰色，續而轉成黑色，隨后逐漸穩定成酒紅色，冷卻至室溫后4℃避光保存；

（3）膠體金標記抗重組豬干擾素ɑ單克隆抗體：用0.1?mol/L?K₂CO₃將膠體金溶液調到pH8.2，然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100?ml溶液加入4.5?mg純化的抗重組豬干擾素ɑ單克隆抗體，將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，再滴加入到終濃度為0.05％的PEG?20000或l％的BSA封閉，標記結束后2500?r/min離心18~22?min，去除大的聚合物，再將上清以12000?r/min離心28~32?min，棄去上清，以含0.05％PEG的0.01?mol/L?PBS重懸沉淀，離心，重復操作兩次，最后以原體積1/10（含0.05％PEG）0.01?mol/L?PBS重懸沉淀，3~5℃保存，然后將標記膠體金溶液加樣于玻璃纖維素膜上，在溫度20~25℃干燥2~4?h，制成膠體金墊，干燥備用；

（4）膠體金標記抗重組豬干擾素ɑ單克隆抗體的純化：先1800r/min、4℃低速離心18~22min，棄去凝聚的沉淀，然后14000r/min、4℃高速離心1~1.2h，吸出上清，沉淀物用0.0l?mol/L?PBS溶液重懸，將沉淀重懸為原體積的1/10，再經1500r/min離心18~22min，取上清加至AKTA^TM?explorer蛋白純化儀葡聚糖凝膠層析柱純化，將純化的膠體金標記結合物過濾除菌、分裝，4℃保存；