[發明專利]一種高產木糖醇的熱帶假絲酵母基因工程菌及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 201310513570.6
• 申請日: 2013-10-28
• 公開（公告）號: CN103614309A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 王成濤;張嬋;尹勝;劉國榮;趙磊;孫寶國;高雪楠;秦魯南
• 申請（專利權）人: 北京工商大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/18;C12R1/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種高產木糖醇的熱帶假絲酵母基因工程菌及其制備方法與應用，屬于食用甜味劑生物制造領域，制備的木糖醇可廣泛應用于食品、醫藥、日化等行業。

背景技術

木糖醇(Xylitol)，也稱戊五醇，是一種五碳多羥基糖醇，化學分子式是C₅H₁₂O₅，外形為結晶性粉末或白色晶體，極易溶于水，味甜，與蔗糖相當，微溶于甲醇和乙醇，熱穩定性好。木糖醇不需要胰島素的參與即能在人體內代謝，亦不會造成人體血糖的急劇變化，因此可作為糖尿病人專用食品的甜味劑，并已廣泛應用于口香糖、膠姆糖、太妃糖、軟糖、巧克力、果凍、冷飲、口含片、漱口劑、潤喉藥物、止咳糖漿等食品、日化及醫藥工業；木糖醇還在卷煙、蓄電池、表面活性劑等方面有許多重要的應用。木糖醇的安全性高，是動物正常代謝的中間產物，人體每天能代謝產生5-15g木糖醇。在自然界中，木糖醇也廣泛存在于多種果蔬(如草毒、青梅等)，但含量很少，通常少于900mg／100g。

目前木糖醇生產主要采用化學合成法：將農業植物纖維廢料(如玉米芯、棉籽殼、蔗糖渣等)水解制得木糖，在高溫高壓條件下，鎳催化劑催化加氫使木糖還原成為木糖醇。該方法要求木糖純度高(95％以上)，生產成本高，設備要求高，副產物成分復雜，環境污染較大。

酵母菌可轉化木糖生成木糖醇，該生化過程的原料木糖無需純化制備，反應條件溫和，無需耐高壓設備，此“綠色”、“清潔”生產技術成為近年研究開發的熱點。研究發現，木糖醇的生物合成與磷酸戊糖途徑(PPP)緊密相連，需要木糖還原酶、還原性輔酶NADPH等參與(木糖+NADPH木糖醇+NADP+)，此還原反應是木糖醇能否順利連續合成的關鍵步驟，NADPH主要是通過PPP途徑產生，若PPP途徑受到破壞，木糖醇產量則明顯降低。Kang研究認為，以木糖為底物發酵時，PPP途徑的多種相關酶活力遠遠高于以葡萄糖為底物時，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)是PPP途徑中催化生成NADPH的關鍵性調控限速酶，因此，提高G6PDH的酶活力是增加NADPH供應量的有效手段之一。為了增強流向PPP途徑的代謝通量及NADPH的再生，Do-Hyun?Kwon等將來源于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的G6PDH編碼基因ZWF1導入經遺傳改造已含有外源木糖脫氫酶基因的釀酒酵母中，改造后重組菌株中G6PDH的酶活力提高了6倍，木糖醇產率達到2g／L／h，與只導入木糖脫氫酶基因的菌株相比，每升發酵液中木糖醇的產率提到了25％。熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)是目前木糖醇生產研究廣泛應用的菌株，本申請專利將葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd進行克隆、過量表達，構建高產穩定表達的木糖醇工程菌，增強目的產物木糖醇的代謝流量與產量，為天然木糖醇生物制備提供菌種和技術支持。

發明內容

本發明提供一種高產木糖醇的熱帶假絲酵母基因工程菌及其制備方法與應用。以Candida?tropicalis?CT₁₆為出發菌株，設計構建木糖醇合成代謝途徑中關鍵酶基因(g6pd)過量表達的代謝工程菌；通過上述技術構建的工程菌(轉化子)SYG5經多次傳代，遺傳性穩定，木糖醇的代謝通量與產量有較大提高；工程菌SYG5在以木糖為主要原料的發酵培養基中高效生產木糖醇。

生物材料樣品保藏相關情況的說明

生物材料樣品保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

保藏單位地址：北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所。

保藏日期：2013年10月18日。

保藏編號：CGMCC?No.8364。

分類命名：熱帶假絲酵母(Candida?tropicalis)SYG5。

具體實施方式

本發明是一種高產木糖醇的熱帶假絲酵母基因工程菌及其制備方法與應用，具體實施方式(技術方案)：

(1)PCR技術從熱帶假絲酵母DNA模板中擴增g6pd基因，連接到穿梭質粒表達載體pYES-pgk，再將重組載體pYES-pgk-g6pd導入C.tropicalis?CT₁₆，使g6pd基因過量表達，篩選陽性轉化子，構建了高產木糖醇的C.tropicalis工程菌SYG5。

(2)分析工程菌SYG5的g6pd基因轉錄水平、G6PDH的酶表達水平、代謝流量分配。

(3)以木糖為主要原料，優化工程菌的發酵培養基和發酵條件，利用發酵罐(生物反應器)發酵生產木糖醇。