[發(fā)明專利]G6PDH基因在提高黑根霉對(duì)甾體C11α-羥基化能力中的應(yīng)用及菌株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310505530.7
• 申請(qǐng)日: 2013-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN103627721A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳小龍;范永仙;朱廷恒;薛海龍;張力偉;沈寅初
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N1/15;C12N15/53;C12R1/845
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及G6PDH基因在提高黑根霉對(duì)甾體C11α-羥基化能力中的應(yīng)用，以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建方法，以及構(gòu)建并篩選獲得的一株甾體C11α-羥基化較高的菌株——黑根霉（Rhizopus?nigericans）PIe。

（二）背景技術(shù)

氧化還原酶催化合成的產(chǎn)物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥等領(lǐng)域，酶催化過程中輔酶不足是限制大多數(shù)氧化還原酶進(jìn)行生物催化合成產(chǎn)物的主要因素。因此，輔酶循環(huán)再生對(duì)于酶催化過程顯得非常重要，進(jìn)而在醫(yī)藥食品等相關(guān)的產(chǎn)品生產(chǎn)中體現(xiàn)重大的價(jià)值。文獻(xiàn)報(bào)道輔酶的再生方法包括酶法、光化學(xué)、電化學(xué)等再生方法，其中尤以酶法再生受到廣泛重視。常用于輔酶再生的酶有醇脫氫酶（ADH）、甲酸脫氫酶（FDH）、葡萄糖脫氫酶（GDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）、亞磷酸脫氫酶（PTDH）等，其中FDH和GDH的研究和應(yīng)用較多，例如，Sheldon研究E.coli?JM109（pGDA2）過量表達(dá)來自于Bacillus?megateriumIWG3葡萄糖脫氫酶基因，當(dāng)提供NADP+和葡萄糖時(shí)，E.coli?JM109（pGDA2）能夠作為NADPH的再生系統(tǒng)。ZhinanXu將Bacillus?megaterium?AS1.223中的葡萄糖脫氫酶基因gdh223通過克隆構(gòu)建pQE30-gdh223表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)由4-氯乙酰乙酸乙酯到（R）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的轉(zhuǎn)化。相對(duì)于FDH和GDH，G6PDH用于輔酶再生的報(bào)道相對(duì)較少。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate?dehydrogenase，G6PDH，EC1.1.1.49）是戊糖磷酸途徑（PPP）氧化階段中催化第一步反應(yīng)的酶和PPP代謝途徑調(diào)控中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控酶。G6PDH廣泛存在于包括細(xì)菌、植物、動(dòng)物等各種生物細(xì)胞中，其催化的反應(yīng)產(chǎn)生大量的還原型輔酶NADPH，NADPH作為負(fù)氫離子供體提供還原力，滿足許多細(xì)胞代謝過程的需要，如脂肪酸固醇類的合成，光合作用中由CO₂合成葡萄糖，核酸合成，維持紅細(xì)胞中還原型谷胱甘肽水平等，因而G6PDH所催化的反應(yīng)在還原性生物合成中具有重要的作用。此外，G6PDH還與細(xì)胞生長發(fā)育，溶血性貧血癥、植物脅迫應(yīng)答、心血管疾病，腫瘤等許多人類疾病有關(guān)。

甾體化合物具有抗炎、抗真菌、免疫抑制、利尿、避孕等作用^[76]，臨床應(yīng)用廣泛，需求量大，已成為醫(yī)藥行業(yè)中僅次于抗生素的第二大類藥物，甾體羥基化中C₁₁α-羥基化是極其重要的甾體反應(yīng)之一，通過C₁₁α-羥基化引入高生理活性基團(tuán)，可以顯著提高甾體藥物的療效，減少副作用，改變作用的專屬性等。1952年P(guān)eterson和Murry等首次利用黑根霉一步轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)孕酮C₁₁α-羥基化生成C₁₁α-羥基孕酮，促進(jìn)了可的松藥物的的產(chǎn)業(yè)化，隨后，微生物轉(zhuǎn)化甾體在甾體藥物的生產(chǎn)中越來越受到重視。經(jīng)過近幾十年的研究，黑根霉生物轉(zhuǎn)化甾體C11α-羥基化工藝和技術(shù)已相對(duì)較成熟，通過誘變育種改善了菌株轉(zhuǎn)化能力，所以在現(xiàn)有菌株和工藝基礎(chǔ)上很難繼續(xù)提高轉(zhuǎn)化率，如何采用新的方法進(jìn)一步改進(jìn)菌株的生產(chǎn)能力就成為該領(lǐng)域人員尤為關(guān)注的問題。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是通過分子生物學(xué)方法將G6PDH克隆至黑根霉中，改造菌種，擬在改造后的黑根霉細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)G6PDH催化NADPH再生，向細(xì)胞色素P450酶系催化的反應(yīng)提供所需要的輔酶，改善黑根霉對(duì)甾體C11α-羥基化的能力。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）基因在提高黑根霉對(duì)甾體C11α-羥基化能力中的應(yīng)用。

具體的，所述應(yīng)用為：構(gòu)建含有G6PDH基因的表達(dá)載體，將其導(dǎo)入黑根霉中，篩選陽性克隆，獲得對(duì)甾體C11α-羥基化能力提高的基因工程菌。

具體的，所述G6PDH基因序列如SEQ?ID?No.1所示：