[發明專利]一種重組大腸桿菌利用甘油生產乳酸的方法

在審

• 申請號: 201310485910.9
• 申請日: 2013-10-17
• 公開（公告）號: CN104560839A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 劉立棟
• 申請（專利權）人: 常州邱鴻生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/56;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域：

本發明屬于微生物基因工程領域，具體地說將參與乳酸生物合成的一個基因克隆并與大腸桿菌高拷貝載體pUC19連接，將重組質粒轉入大腸桿菌中，使用氨芐青霉素作為篩選標記，以加強該基因在大腸桿菌中的表達量，使乳酸可以在大腸桿菌中大量合成。

背景技術：

乳酸(Lactate)又名2-羥基丙酸，α-羥基丙酸或丙醇酸，廣泛存在于自然界中，乳酸、乳酸鹽及其衍生物是重要的生物化工產品，在啤酒釀造、醫藥、食品及食品保鮮、化妝品，卷煙、皮革、印染、化工等領域有著廣泛的應用。乳酸純品為無色液體，熔點18℃，沸點122℃。能與水、乙醇、甘油混溶，不溶于氯仿、二硫化碳和石油醚。分子式為C₃H₆O₃。乳酸中心有不對稱碳原子，因此具有旋光性，可分為是L-型，D-型和DL-型。以L-乳酸為單體經化學合成的新型高分子材料一聚乳酸，具有優良的生物可降解性，能最終降解成二氧化碳和水，屬環保型材料，可以用來解決日益嚴重的“白色污染”問題。由于L-乳酸是皮膚固有天然保濕因子，所以被廣泛用作許多護膚品的滋潤劑。很多微生物能夠發酵生產D-乳酸，一些乳酸菌如保加利亞乳桿菌(Lactobacillus?bulgaricus)能夠生產高純度的D-乳酸。但是人體只能代謝L-乳酸。自然界中很多菌如一些乳酸菌：乳桿菌(Lactobacillus?helveticus)、嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillus?amylophilus)和德式乳桿菌(Lactobacillus?delbruckii)則能夠生產L-乳酸。(錢志良，勞含章，王健。2003.)

目前國內外發酵制備乳酸所用原料多集中于農副產品，也有利用纖維等廢棄物發酵乳酸的報道。但是大部分的研究還是集中于以糖質資源為原料進行乳酸的生產發酵，如以玉米淀粉或玉米粉發酵制備乳酸；以大米粉發酵制備乳酸；以紅薯淀粉發酵制備乳酸。以糖質資源發酵乳酸的工藝較為復雜，發酵制備L-乳酸原料利用方式的不同決定整個工藝的進程，影響生產的成本。目前發酵制備L-乳酸對原料的利用方式主要集中于：①先經液化再糖化，進而再發酵制備乳酸的發展方向是對淀粉質原料的直接應用，經微生物利用；②糖化和發酵同時進行；③對淀粉質原料先萌發再進行發酵；④對淀粉質原料直接進行利用，不經過液化糖化處理，可簡化工藝過程，但對菌種要求較高，目前產率較低。如果生產乳酸的過程中不需經過液化和糖化，這樣可以大大簡化工序、降低成本，為實現大規模的工業化生產奠定基礎。但是，糧食資源日益緊張的今天，以糖質資源為原料發酵乳酸的過程不僅生產工藝復雜，而且糧食成本也日益增加。導致以糖為底物的發酵生產前景堪憂。此時，開發以廉價的非糧糖質為原料發酵生產乳酸具有很好的發展前景。(Ohkouchi?Y.，Inoue?Y.2006，Yu?R.C.，Hag?Y.D.1989.)。因此，我們使用了可以利用甘油的大腸桿菌作為生產菌株。大腸桿菌具有生物量較大，發酵周期短，生物背景明確，可以利用甘油這一非糖質底物等優點。由于現代工業在通過植物油和動物脂肪生產石油的過程中產生大量的廢棄甘油，這些廢棄甘油的比重高達10％，因此，使用大腸桿菌以甘油為底物生產乳酸可以使原料成本降低，并且可以保護環境。

發明內容：

本發明的目的是獲得一種使用甘油為底物高產乳酸的大腸桿菌菌株的制備方法。本發明的另一目的是公開了高產乳酸的基因工程菌的發酵方法。

本發明以大腸桿菌BW25141(美國E.coli?Genetic?Resources?at?Yale，The?Coli?Genetic?Stock?Center)為出發菌株，將一個與合成乳酸有關的基因通過大腸桿菌高拷貝載體pUC19(美國New?England?BioLabs公司)轉入大腸桿菌中，從而獲得高產乳酸的基因工程菌LDH16172。得到的菌株可以用甘油作為碳源生產乳酸。

本發明的上述目的是通過以下技術方案達到的：

一種使用甘油為底物高產乳酸的大腸桿菌菌株的制備方法，其步驟如下：

1)基因片段的克隆

利用引物序列1

GGGAAAGGTACCatgCGCATCCTGTTCTTCAGCACCC

引物序列2

GGGAAATCTAGAtcaGGCCCGGACCCGATTGCGTGGC

PCR擴增基因片段ldhA