[發明專利]堿基序列分析方法和堿基序列分析裝置

無效

• 申請號: 201310485308.5
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103773840A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 中村友彥;梶原淳志
• 申請（專利權）人: 索尼公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/38;C12M1/34
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 吳孟秋;梁韜

相關申請的交叉引用

本申請要求于2012年10月23日提交的日本在先專利申請2012-234227的權益，將其全部內容通過引用結合于此。

技術領域

本技術涉及堿基序列分析方法、堿基序列分析裝置以及堿基序列分析程序。具體地，本技術涉及包括渾濁度測量步驟和熔解曲線分析步驟的堿基序列分析方法等。

背景技術

雙鏈核酸鏈解離（熔解）成兩個單鏈核酸的溫度稱為熔解溫度（Tm值）。在熔解曲線分析中，通過檢測由于在雙鏈核酸鏈逐漸地被加熱并熔解為兩個單鏈核酸時出現熔解而改變的信號，測量與溫度的變化有關的信號檢測量的變化。可從通過繪制與溫度的變化有關的信號檢測量的變化獲得的熔解曲線確定熔解溫度。因為熔解溫度反映兩個單鏈核酸之間的同源關系，所以兩個單鏈核酸之間的同源關系可基于熔解溫度來確定。因此，熔解曲線分析用于分析核酸，例如，核酸擴增反應的特異性的驗證和單核苷酸多態性（SNP）等的基因型確定。

熒光物質通常用于檢測雙鏈核酸鏈的熔解。例如，通過熒光標記能夠與靶核酸鏈形成雙鏈核酸鏈的核酸探針，基于當靶核酸鏈和核酸探針解離時通過熒光標記的光的發射或消失可檢測核酸鏈的解離。此外，使用通過嵌入雙鏈核酸來產生熒光的嵌入劑可檢測從雙鏈至單鏈的變化。

熒光物質不限于熔解曲線分析，其也廣泛地用于擴增后核酸鏈的檢測和定量及其他這樣的核酸分析。另一方面，對于擴增后核酸鏈的檢測，也可不使用熒光物質而采用檢測樣本的渾濁度的方法。在使用DNA合成酶的延伸反應中，反應溶液中的作為副產物產生的焦磷酸與鎂離子結合，由此形成焦磷酸鎂。如果產生的焦磷酸鎂的量超過樣品的可溶水平，焦磷酸鎂沉淀且反應溶液變濁。通過測量渾濁度的水平，可實施對擴增后核酸鏈檢測和量化。

因此，例如，JP-A-2012-34617公開的“核酸擴增反應裝置包括：第一光源，被配置為輸出用于激發熒光物質的光；第二光源，被配置為輸出波長區域與由熒光物質產生的熒光的波長區域匹配的光；以及控制單元，被配置為通過在第一光源和第二光源之間切換來發射光；其中，通過使來自第一光源的光和來自第二光源的光沿著光路（通過光引導構件使兩個光束在該光路上重疊）通過并照射在用作核酸擴增反應的反應場所的反應區上，可檢測隨著擴增反應的進行形成的渾濁物質所產生的光量和隨著擴增反應的進行由光激發的熒光物質所產生的熒光的強度。”

發明內容

當通過核酸擴增反應在擴增后核酸鏈上執行上述熔解曲線分析時，因為熔解曲線分析在核酸已被擴增后開始，所以要在預定時間執行從核酸擴增反應到熔解曲線分析的切換。

根據本公開的實施方式，提供一種能夠連續地執行核酸擴增反應和熔解曲線分析的堿基序列分析方法。

根據本公開的實施方式，提供一種堿基序列分析方法包括：通過核酸擴增反應獲得擴增產物的核酸擴增步驟，測量核酸擴增反應的反應溶液的渾濁度的渾濁度測量步驟，以及對位于核酸擴增反應的反應場所執行探針核酸鏈和擴增產物的熔解曲線分析的溶解曲線分析步驟。

優選的是，當渾濁度達到預定值時執行熔解曲線分析步驟。

此外，優選的是，探針核酸鏈具有比核酸擴增反應的反應溫度低的熔解溫度。

此外，優選的是，探針核酸鏈具有比核酸擴增反應中使用的引物的熔解溫度低的熔解溫度，并且在探針核酸鏈存在下執行核酸擴增反應。

探針核酸鏈可具有比引物的熔解溫度低5-15℃的熔解溫度。

各自具有不同的堿基序列的多個探針核酸鏈可被用作探針核酸鏈。

各自具有不同的堿基序列的多個探針核酸鏈可各自被發射不同波長的光的熒光物質標記。在具有不同的堿基序列的多個探針核酸鏈中，一個探針核酸鏈可完全地匹配（match，一致）包含在擴增產物中的堿基序列的一部分。

核酸擴增反應可以是等溫核酸擴增反應。等溫核酸擴增反應可通過環介導等溫擴增方法來執行。

根據本公開的實施方式，提供堿基序列分析裝置包括：光源，被配置為將照射光輸出在反應場所上，檢測單元，被配置為檢測由于照射光而從反位于應場所中的核酸擴增反應溶液產生的光，溫度調節單元，被配置為加熱或者冷卻反應場所；以及控制單元，被配置為基于檢測單元的信號輸入來切換光源的驅動模式。控制單元被配置為將驅動模式從核酸擴增反應模式切換至熔解曲線分析模式。

優選的是，光源包括第一光源和第二光源，并且從第一光源輸出的光的波長與從被包含在利用第二光源的光照射的核酸擴增反應溶液中的熒光物質產生的熒光的波長區域匹配。