[發明專利]一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法

無效

• 申請號: 201310481326.6
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103555832A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 俞曄;王周平;袁京磊;杜國興;周強;王玥
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國張家港出入境檢驗檢疫局;江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12R1/445
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛;汪青

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛分布,可以引起食物中毒和胃腸炎等多種疾病。根據美國疾病預防與控制中心的統計,由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒,占到整個細菌性食物中毒病例的33%,位居第二位,而加拿大則高達45%。傳統的檢測方法由于其操作復雜、特異性以及靈敏度不好的缺點,已經無法滿足人們對于食品安全越來越高的要求了。因此,對于食品中金黃色葡萄球菌的快速、準確的檢測,越來越引起人們的關注。

傳統的檢測方法主要是應用國標法進行檢測,但是國標法需要較長的時間才能得到準確的檢測結果,無法滿足快速檢測的目的。目前快速檢測金黃色葡萄球菌的方法主要有紙片法、免疫學方法、分子生物學方法和生物傳感器檢測法等四種方法。其中免疫學的方法主要有免疫熒光法(IFA)、酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫沉淀法、免疫層析法、免疫磁珠法、免疫印跡技術等。分子生物學的方法主要包括PCR技術、基因芯片等。這些方法各有其優缺點,其中一些存在如成本較高、操作復雜、穩定性差等問題,一定程度上限制了其推廣與應用。

因此,非常有必要開發一種成本較低、操作簡單、特異性強、靈敏度高、檢測時間較短的金黃色葡萄球菌的檢測技術。納米金由于具有獨特的光學、化學、電化學及催化性能,已被廣泛應用于生物學和化學傳感器的研究中。近年來,應用納米金及納米金的團聚對靶物質進行可視化檢測的報道越來越多,這些靶物質主要包括一些食源性致病菌、毒素、金屬離子、農藥殘留、食品非法添加劑等,納米金除了在檢測方面有著十分重要的應用外,在生命科學分析及癌癥的診斷與治療方面也有著非常廣泛的應用。但是，到目前為止，還沒有將納米金用于金黃色葡萄球菌的檢測中。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種靈敏度高的基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法。

為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案：

一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，將與金黃色葡萄球菌的目標DNA互補配對的且經巰基修飾的DNA1和DNA2分別與10～14納米的納米金連接制成DNA1-適配體探針和DNA2-適配體探針，用DNA提取試劑盒提取待測物中的DNA,然后將所述的DNA1-適配體探針和DNA2-適配體探針混勻后，加入所述的待測物中的DNA，混勻，在90～95℃熱處理4～6分鐘后，降溫至37℃以下，在400～900納米進行UV-vis掃描，即可實現對待測物中的金黃色葡萄球菌的定量檢測。

具體地，所述的金黃色葡萄球菌的目標DNA序列為5′-CGA?GGA?TTT?TCC?AAT?GAG?GTG?GCC?GA-3′。

具體地，所述的DNA1的序列為5′SH-TCG?GCC?ACC?TCA?T-3′，所述的DNA2的序列為5′-TGG?AAA?ATC?CTC?G-3′SH。

具體地，所述的納米金的制備方法包括依次進行的如下步驟：

（1）用王水對容器進行浸泡，然后用超純水對所述的浸泡后的容器進行清洗并烘干；

（2）在所述的烘干后的容器中按體積比為100～125：1加入所述的超純水和質量百分濃度為2～3%氯金酸溶液，攪拌均勻后煮沸8～12分鐘，然后加入質量百分濃度為0.8～1.2%的檸檬酸三鈉溶液，繼續煮沸8～12分鐘，其中所述的檸檬酸三鈉溶液與所述的氯金酸溶液的體積比為10～13:1；

（3）停止加熱，繼續攪拌12～18分鐘，冷卻至10～40℃，即得所述的納米金。

具體地，所述的超純水的電阻率大于等于18.2MΩ.cm。

具體地，所述的DNA1-適配體探針制備方法包括依次進行的如下步驟：

（1）將所述的納米金在3～5℃，13000～15000r/min離心30～40分鐘后，吸出上清液；

（2）將濃度為10^-5mol/L的DNA1加入到所述的上清液中，在35～40℃下搖床孵育20～30小時，形成納米金-DNA1溶液，其中，所述的DNA1、上清液的體積比為1:45～55；

（3）將十二烷基磺酸鈉（SDS）加入到所述的納米金-DNA1溶液中，然后再分多次加入0.8～1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的終濃度達到0.3～0.4mol/L，每次加入所述的NaCl后，超聲處理8～12秒；

（4）將經步驟（3）處理后的納米金-DNA1溶液在35～40℃陳化20～30小時；