[發明專利]一種菌糠高溫分解復合菌劑及其制備方法

有效

• 申請號: 201310478232.3
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103614315A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 郭鵬;程薇;周明;陳明利;高虹;王晨;楊德;李露;薛淑靜;史德芳
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/145;C12R1/01
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

1.一種快速有效的菌糠高溫分解復合菌劑，其特征在于由菌株保藏號ATCC51176，DSM3670Aeribacillus?pallidus、菌株保藏號DSM2027，ATCC7954Geobacillus?stearothermophilus、菌株保藏號DSM7064Brevibacillus?thermoruber、菌株保藏號ATCC43739，DSM2910Clostridium?stercorarium?subsp.thermolacticum、菌株保藏號NCIB10682，ATCC27405Clostridium?thermocellum、菌株保藏號DSM574，ATCC19858Desulfotomaculum?nigrificans、菌株保藏號DSM21625Geobacillus?thermoglucosidasius、菌株保藏號DSM24528Symbiobacterium?thermophilum8株嗜熱細菌按在復合菌劑中的細胞數含量分別為10%-20%、10%-20%、2%-5%、10%-15%、15%-20%、5%-10%、10%-15%、15%-20%的比例混合發酵所得的復合菌劑；

菌株在混合發酵中的細胞數含量的含義是指復合菌劑中各菌株細胞數占復合菌總細胞數的百分含量。

2.制備權利要求1所述的一種快速有效的菌糠高溫分解復合菌劑的方法，其特征在于8株細菌各自培養好后進行復合菌發酵；具體步驟如下：

（1）8株細菌各自培養，其培養方法分別為：

菌株保藏號ATCC51176，DSM3670Aeribacillus?pallidus的培養，將由葡萄糖1.0g，蛋白胨7.5g，牛肉膏5.0g，酵母粉2.5g，酪蛋白氨基酸2.5g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000.0ml組成的培養基，pH值調整至8.5；60℃避光靜止培養48h；

菌株保藏號DSM2027，ATCC7954Geobacillus?stearothermophilus的培養，將由氯化鈉5.0g，牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，蒸餾水1000.0mL組成的培養基，pH值調整：至7.2；60℃避光靜止培養48h；

菌株保藏號DSM7064Brevibacillus?thermoruber的培養，將由葡萄糖15.0g，酵母粉5.0g，二水氯化鈣0.2g，蒸餾水1000.0ml組成的培養基，pH值調整至7.0；60℃避光靜止培養48h；

菌株保藏號ATCC43739，DSM2910Clostridium?stercorarium?subsp.thermolacticum的培養，將由磷酸氫二鉀0.3g，磷酸二氫鉀0.2g，氯化銨0.5g，七水硫酸鎂0.5g，二水氯化鈣0.25g，氯化鈉2.25g，七水硫酸亞鐵0.002g，維生素溶液10.0ml，微量元素溶液1.0ml，酵母粉2.0g，酪蛋白胨2.0g，刃天青0.001g，碳酸氫鈉0.85g，甲醇10.0ml，L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物0.3g，九水硫化鈉0.3g，蒸餾水1000.0ml組成的培養基，pH值調整至6.8；在80%N₂+20%CO₂厭氧條件下，60℃黑暗靜止培養72h；

所述維生素溶液為Biotin2.0mg，Folic?acid2.0mg，Pyridoxine-HCl10.0mg，Thiamine-HCl·2H₂O5.0mg，Riboflavin5.0mg，Nicotinic?acid5.0mg，D-Ca-pantothenate5.0mg，Vitamin?B₁₂0.1mg，p-Aminobenzoic?acid5.0mg，Lipoic?acid5.0mg，加蒸餾水定容至1000.0ml的溶液；

所述微量元素溶液為7.7M?HCl10.0ml，FeCl₂·4H₂O1.5g，ZnCl₂70.0mg，MnCl₂·4H₂O100.0mg，H₃BO₃6.0mg，CoCl₂·6H₂O190.0mg，CuCl₂·2H₂O2.0mg，NiCl₂·6H₂O24.0mg，Na₂MoO₄·2H₂O36.0mg，加蒸餾水定容至1000.0ml的溶液；

菌株保藏號NCIB10682，ATCC27405Clostridium?thermocellum的培養，將由硫酸銨1.3g，六水氯化鎂2.6g，磷酸二氫鉀1.43g，磷酸氫二鉀5.5g，二水氯化鈣0.13g，β-磷酸甘油二鈉四水合物6.00g，七水硫酸亞鐵1.10mg，還原型谷胱甘肽0.25g，酵母粉4.5g，刃天青1.0mg，微晶纖維素10.0g，蒸餾水1000.0ml組成的培養基，pH值調整至7.2；在80%N₂+20%CO₂厭氧條件下，60℃黑暗靜止培養72h；

菌株保藏號DSM574，ATCC19858Desulfotomaculum?nigrificans的培養，將由磷酸氫二鉀0.5g，氯化銨1.0g，硫酸鈉1.0g，二水氯化鈣0.1g，七水硫酸鎂2.0g，DL-乳酸鈉2.0g，酵母粉1.0g，刃天青1.0mg，七水硫酸亞鐵0.5g，巰基乙酸鈉0.1g，抗壞血酸0.1g，蒸餾水1000.0ml組成的培養基，pH值調整至7.8；在80%N₂+20%CO₂厭氧條件下，60℃黑暗靜止培養72h；

菌株保藏號DSM21625Geobacillus?thermoglucosidasius的培養，將由酪蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000.0ml組成的培養基，pH值調整至7.3；60℃黑暗靜止培養48h；

菌株保藏號DSM24528Symbiobacterium?thermophilum的培養，將由氯化鈉5.0g，硝酸鈉1.7g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，碳酸氫銨3.2g，蒸餾水1000.0ml組成的培養基，，pH值調整至7.8；在80%N₂+20%CO₂厭氧條件下，60℃黑暗靜止培養72h；

（2）復合菌發酵

將經步驟（1）培養好的8株細菌按照比例混合均勻后即獲得混合菌種原液，將相當于培養液體積5%的混合菌種原液接種于發酵培養液中，在60℃下黑暗靜止培養5天，得復合菌液；

所述混合發酵培養液為：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，碳酸鈣3g，氯化鈉5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.35g，菌糠粉10g，蒸餾水1000.0mL，pH值為7.8，121℃滅菌20min；

所述8株細菌的混合比例為：菌株保藏號ATCC51176，DSM3670Aeribacillus?pallidus、菌株保藏號DSM2027，ATCC7954Geobacillus?stearothermophilus、菌株保藏號DSM7064Brevibacillus?thermoruber、菌株保藏號ATCC43739，DSM2910Clostridium?stercorarium?subsp.thermolacticum、菌株保藏號NCIB10682，ATCC27405Clostridium?thermocellum、菌株保藏號DSM574，ATCC19858Desulfotomaculum?nigrificans、菌株保藏號DSM21625Geobacillus?thermoglucosidasius、菌株保藏號DSM24528Symbiobacterium?thermophilum在混合菌種中細胞數含量分別為10%-20%、10%-20%、2%-5%、10%-15%、15%-20%、5%-10%、10%-15%和15%-20%；

（3）細菌吸附載體的制備：將80℃烘干的菌糠粉碎后，過0.4mm篩子備用；

（4）復合菌吸附發酵：在步驟（3）的菌糠粉中加入占菌糠粉重量的0.2%蛋白胨、0.3%魚粉、0.25%酵母粉和50%自來水，邊攪拌邊噴灑占菌糠粉重1%的，由步驟（2）所得的復合菌液，置于發酵罐內，60℃避光保溫培養，每24小時均勻攪拌1次，每隔48小時重復噴灑同樣的菌液，共噴灑3次，第3次噴灑菌液量為菌糠粉重的20%，噴灑后避光保溫培養12小時，攪拌均勻后置于60℃烘干，當總體水分含量為20%時停止干燥，得復合菌劑制品。

3.根據權利要求2所述的制備的一種快速有效的菌糠高溫分解復合菌劑的方法，其特征在于細菌吸附載體為木屑菌糠、棉籽殼菌糠、木屑棉籽殼菌糠、棉稈菌糠、玉米芯秸稈菌糠。