[發明專利]喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡及其制備方法

有效

• 申請號: 201310478059.7
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103499690A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 張慧輝;姜金慶;王自良;李廣領;楊雪峰;范國英;楊理;趙旭娜;劉長忠
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 新鄉市平原專利有限責任公司 41107
• 代理人: 路寬

1.一種喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡，其特征在于包括塑料卡殼和封裝于塑料卡殼內的試紙條，所述的塑料卡殼是由底座和面蓋嵌合在一起構成的，底座上設有放置試紙條的槽和與面蓋相嵌合的卡口，面蓋上設有觀察窗和加樣孔以及與底座相嵌合的卡齒，在觀察窗旁邊分別印有代表檢測線的T和代表質控線的C，其中代表檢測線的T靠近加樣孔的一側；所述的試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有交疊連接的樣品墊、金標墊、檢測墊和吸水墊，其中檢測墊的位置與塑料卡殼上觀察窗的位置相對應，樣品墊的位置與塑料卡殼上加樣孔的位置相對應，所述的檢測墊以硝酸纖維素膜為基礎，包含3-甲基喹噁啉-2-羧酸-雞卵清白蛋白偶聯物溶液噴涂的檢測線和羊抗鼠IgG溶液噴涂的質控線，所述金標墊上灌注有膠體金標記的抗喹乙醇代謝物特異性單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡，其特征在于：所述的樣品墊、金標墊和吸水墊上方覆蓋有膠膜保護層。

3.一種權利要求1所述的喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）樣品墊的制備：將玻璃纖維棉用含有質量濃度為2%的BSA、質量濃度為1%的蔗糖、質量濃度為0.5%的硼酸鈉和質量濃度為0.1%的NaN₃的PBS緩沖液處理后，干燥備用，即為樣品墊；

（2）金標墊的制備：將玻璃纖維棉裁成4?mm寬的細條，放入含有質量濃度為5%的BSA、質量濃度為2%的蔗糖、質量濃度為0.8%的NaCl和質量濃度為0.05%的NaN₃的PBS緩沖液中20?min，37?℃恒溫烘干，然后將膠體金標記的抗喹乙醇代謝物特異性單克隆抗體灌注已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4?h，即為金標抗體結合墊；

（3）檢測墊的制備：將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點儀平臺上，3-甲基喹噁啉-2-羧酸-雞卵清白蛋白偶聯物溶液放于A池，羊抗鼠IgG溶液放于B池，展平壓緊，開機后將檢測抗原和二抗分別點射噴涂于硝酸纖維素膜上，形成檢測線和質控線，室溫自然干燥后，將其浸入BSA質量濃度為1%的PBS緩沖液，pH值為7.4的封閉液中30?min，37?℃烘干后，加入干燥劑，4?℃密封保存；

（4）吸水墊的制備：將以植物長纖維為原材料制作的純白濾紙用切割機切成4mm寬的細條，并用膠膜進行一側封閉，干燥備用，即為吸水墊；

（5）喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡的制備：首先將制備的樣品墊、金標墊、檢測墊和吸水墊依次附著于支撐層上，由左到右交疊連接，疊壓寬度2?mm，然后用切割機制成寬4?mm，長60?mm的試紙條，封裝于帶有加樣孔和觀察窗的塑料卡殼內，即制得喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡。

4.根據權利要求3所述的喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡的制備方法，其特征在于：所述的檢測線上噴涂的檢測抗原是3-甲基喹噁啉-2-羧酸-雞卵清白蛋白偶聯物溶液，其制備方法為：在N,N-二環已基碳二亞胺活化和催化下，喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原與N-羥基琥珀酰亞胺發生酯化反應，反應產物再與雞卵清白蛋白偶聯，即制得檢測抗原。

5.根據權利要求3所述的喹乙醇代謝物免疫層析試紙卡的制備方法，其特征在于：所述的金標墊上標記的抗體是抗喹乙醇代謝物特異性單克隆抗體，其制備方法為：（1）人工抗原合成：采用活潑酯法將喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸和載體蛋白偶聯，制得免疫原和包被原；（2）動物免疫：以雌性Balb/C小鼠作為免疫動物，背皮下多點注射法免疫5-6次；（3）細胞融合：在聚乙二醇1500的作用下，將免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤NS0細胞進行融合；（4）雜交瘤細胞株篩選：用間接ELISA和間接競爭ELISA篩選強陽性、抑制率高、生長狀態好的雜交瘤細胞株；（5）細胞亞克隆：采用有限稀釋法將陽性孔細胞株進行亞克隆，制得純化的單克隆源雜交瘤細胞；（6）單抗制備：體內誘生腹水法制備抗喹乙醇代謝物單克隆抗體，飽和硫酸胺法純化抗體后，進行膠體金標記。