[發(fā)明專利]一種檢測(cè)蚜蟲非特異性酯酶活性的方法及檢測(cè)試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310476436.3
• 申請(qǐng)日: 2013-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN103497990A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高希武;劉曉嵐;湯秋玲;李永丹;梁沛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/44
• 分類號(hào): C12Q1/44
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)有機(jī)磷抗藥性的快速生化檢測(cè)方法及混合底物檢測(cè)試劑盒

背景技術(shù)

昆蟲抗藥性的形成和發(fā)展給化學(xué)防治造成了很大困難，如何快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)蚜蟲抗藥性水平是非常重要的。在昆蟲抗藥性檢測(cè)方面目前主要是使用生物測(cè)定法和酶活性分析法，前者使用蟲量大，操作復(fù)雜，不易掌握；后者對(duì)操作條件要求高，而且需要一定的儀器設(shè)備等條件，不適合在基層和田間推廣使用。

目前蚜蟲對(duì)有機(jī)磷的抗性檢測(cè)主要是通過傳統(tǒng)的生物測(cè)定—葉片藥膜法進(jìn)行：取新鮮無污染的甘藍(lán)葉片浸在系列濃度的有機(jī)磷類藥液中15秒，以蒸餾水（含0.05%Triton-X100）作對(duì)照，室內(nèi)晾干后接大小一致的無翅成蚜20頭，每個(gè)濃度3次重復(fù)，24小時(shí)后檢查結(jié)果。然后用POLO或SAS軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算LC₅₀值，根據(jù)LC₅₀值的比較來判斷蚜蟲對(duì)有機(jī)磷類藥劑的抗性水平。

有機(jī)磷殺蟲藥劑作用于昆蟲非特異性酯酶，昆蟲非特異性酯酶活性越高，表明對(duì)藥劑抗性越高。非特異性酯酶活性越高，分解其底物α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯能力越強(qiáng)，分解產(chǎn)物與顯色劑結(jié)合顯色就越深。因此顯色越深的個(gè)體，表明其對(duì)有機(jī)磷藥劑抗性越強(qiáng)。1981年Nicole?Pasteur和George?P.使用濾紙法測(cè)定蚊蟲對(duì)有機(jī)磷的抗性(Nicole?Pasteur,George?P.1981.Mosquito?News:Filter?paper?test?for?rapid?determination?of?phenotypes?with?high?esterase?activity?in?organophosphate?resistant?mosquitoes[J])。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)與有機(jī)磷類殺蟲劑抗性相關(guān)的蚜蟲非特異性酯酶活性的方法及檢測(cè)試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種檢測(cè)蚜蟲非特異性酯酶（NSE）活性的方法，其是將底物α-乙酸萘酯（α-NA）和底物β-乙酸萘酯（β-NA）按1:1等體積混合作為混合底物，制備吸附混合底物的濾紙；采集蚜蟲田間種群，勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)比，濾紙顯色越深，個(gè)體酶活性越高。

進(jìn)一步地，所述方法具體包括以下步驟：

（1）配制底物：用丙酮配制質(zhì)量濃度（w/v）為1%的α-乙酸萘酯和質(zhì)量濃度（w/v）為1%的β-乙酸萘酯，4℃冰箱保存；

（2）將步驟（1）配制的底物按1:1等體積混合，將濾紙浸入其中，2min后，室溫陰干；

（3）用pH7.0的磷酸緩沖液配制0.15%的固藍(lán)B鹽作為勻漿液，勻漿單頭蚜蟲，取1/20體積的勻漿液滴到步驟（2）中制備的濾紙上，室溫避光放置15min；

（4）待顯色完全后，統(tǒng)計(jì)步驟（3）中的個(gè)體顯色顏色，與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)比，濾紙顯色越深，個(gè)體酶活性越高。

其中，步驟（3）中pH7.0的磷酸緩沖液，是由磷酸二氫鉀（KH2PO4）和十二水合磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄·12H₂O）配制，濃度為0.04M。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)蚜蟲非特異性酯酶活性的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括：

（1）吸附有混合底物的濾紙：

將丙酮配制的質(zhì)量濃度為1%的α-乙酸萘酯和質(zhì)量濃度為1%的β-乙酸萘酯等體積混合，吸附于定性濾紙上，陰干，錫箔紙包裹于4℃保存；

（2）顯色劑緩沖液：以0.04M、pH7.0的磷酸緩沖液配制0.15%的顯色劑固藍(lán)B，該顯色劑須現(xiàn)配現(xiàn)用。

本發(fā)明還提供了利用前述檢測(cè)蚜蟲非特異性酯酶活性的方法，檢測(cè)蚜蟲種群抗性個(gè)體頻率的方法。

具體為，采集蚜蟲田間種群，按照前述方法勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)比，統(tǒng)計(jì)個(gè)體顯色顏色，每一種群重復(fù)檢測(cè)100頭以上，計(jì)算種群抗性個(gè)體頻率；

所述抗性為有機(jī)磷抗性。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明以α-乙酸萘酯（α-NA）和β-乙酸萘酯（β-NA）混合底物對(duì)蚜蟲田間種群的非特異性酯酶的生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各測(cè)試種群抗性個(gè)體頻率與生物測(cè)定數(shù)據(jù)存在明顯相關(guān)性。

因此，本發(fā)明所述方法能夠通過檢測(cè)個(gè)體非特異性酯酶（NSE）活性來判斷田間種群的抗性水平。通過吸附混合底物的濾紙上個(gè)體顯色顏色的深淺，與標(biāo)準(zhǔn)色板比較，從而得到抗性個(gè)體頻率，進(jìn)而了解種群抗性水平。