[發(fā)明專利]一種基于酪胺信號放大技術(shù)和適配體識別的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310473852.8
• 申請日: 2013-10-11
• 公開（公告）號: CN103513033A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王周平;袁京磊;何良興;茹巧美
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明主要是通過金黃色葡萄球菌適配體對金黃色葡萄球菌的特異性識別，并且通過酪胺信號放大的方法來實(shí)現(xiàn)可視化檢測的。本發(fā)明涉及到分子生物學(xué)和微生物學(xué)的方法及技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近些年來，食品質(zhì)量與安全越來越引起人們的關(guān)注，并逐漸成為了一個社會焦點(diǎn)和熱點(diǎn)問題，這其中由食源性致病菌引起的食品安全問題還是比較多的。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，它會產(chǎn)生一些對人體有毒的物質(zhì)，比如毒素、酶和一些菌體成分。根據(jù)美國疾病預(yù)防與控制中心的統(tǒng)計(jì)，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，占到整個細(xì)菌性食物中毒病例的33％，位居第二位，而加拿大則高達(dá)45％。因此研究一種能夠?qū)瘘S色葡萄球菌實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、可靠的檢測方法是非常有必要的。但是一些傳統(tǒng)的檢測方法由于在特異性、靈敏度和操作方面存在著各種缺陷，無法滿足人們對于食品安全的要求。

適配體是一種具有能夠與靶分子高親和性和特異性結(jié)合的一段DNA或RNA序列，這些靶分子包括一些藥物、蛋白和其他有機(jī)、無機(jī)小分子，它是利用體外篩選技術(shù)一指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment,SELEX)，從含有10¹³-10¹⁵不同隨機(jī)序列的DNA或RNA核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。此外由于適配體具有穩(wěn)定、容易合成和進(jìn)行化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)，因此，適配體被廣泛的應(yīng)用于分析檢測、疾病的診斷和治療等方面，并且適配體在生物、化學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用前景。

酪胺信號放大(TSA)技術(shù)是一種基于辣根過氧化物酶(HRP)催化的生物信號放大技術(shù)，其原理是在HRP酶催化下，大量連接半抗原的酪胺分子的沉積，這些半抗原主要是生物素、熒光光素等小分子物質(zhì)。目前TSA技術(shù)在分子原位雜交、ELISA、分析檢測、疾病診斷等方面有著十分廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有檢測技術(shù)在檢測的靈敏度、檢測時(shí)間以及特異性上存在的缺陷，本發(fā)明主要是針對這些缺陷，提供了一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的可視化檢測金黃色葡萄球菌的新方法。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

(1)由于金黃色葡萄球菌適配體能夠高親和力和特異性的與靶物質(zhì)結(jié)合，因此本方法具有較高的特異性。

(2)本發(fā)明中所涉及的各種試劑廉價(jià)易得，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本，并且實(shí)驗(yàn)的操作步驟比較簡單，因此，本發(fā)明在成本及實(shí)驗(yàn)操作具有優(yōu)勢。

(3)本發(fā)明對金黃色葡萄球菌的檢測限比較低，達(dá)到了8cfu／mL；而且檢測范圍較大，在10⁷-10cfu／mL范圍內(nèi)線性良好(R²=0.9976)。

附圖說明

圖1是特異性實(shí)驗(yàn)；a.金黃色葡萄球菌，b.鼠傷寒沙門氏菌，c.副溶血性弧菌，d.化膿鏈球菌，e.阪崎桿菌，f.大腸桿菌，g.單增李斯特菌。

圖2是標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3是酪胺放大技術(shù)在本實(shí)驗(yàn)中的作用；a.未應(yīng)用酪胺信號放大技術(shù)的檢測方法，b.本方法

圖4是本方法與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、合成生物素修飾的金黃色葡萄球菌適配體(上海生工生物工程股份有限公司完成)。

生物素修飾的適配體：5'-biotin-C6-GCA?ATG?GTA?CGG?TAC?TTC?CTC?GGC?ACG?TTC?TCA?GTA?GCG?CTC?GCT?GGT?CAT?CCC?ACA?GCT?ACG?TCA?AAA?GTG?CAC?GCT?ACT?TTG?CTAA-3’。

2、制備生物素-酪胺。

準(zhǔn)確稱取10mg?Bio-NHS,溶于1mL?DMF中制成溶液A；稱取2.8mg的酪胺鹽酸，溶于0.28mL?DMF中，然后加入2.8μL的三乙胺，制成溶液B；將溶液A與溶液B充分震蕩混勻，然后在室溫下避光反應(yīng)2h，加入8.72mL無水乙醇，從而制得10mL生物素-酪胺溶液，并于4℃環(huán)境避光保存。

3、親和素包被酶標(biāo)板

將親和素(1mg/mL)用碳酸鹽包被液(Na₂CO₃0.16g，NaHCO₃0.29g，100mL?H₂O：pH9.6)按1：100稀釋，每孔包被200μL，置于4℃環(huán)境，12h，拍干，用1×PBST(1×PBS緩沖液+0.05％(v／v)吐溫20)洗滌3次，每次1分鐘，拍干。