[發(fā)明專利]一種快速高效的水稻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310467412.1
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN103710377A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱英;段煉;徐恒;錢君;郭小雨
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/04
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 陳繼亮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及涉及水稻原生質(zhì)體的分離的新方法以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的相關(guān)應(yīng)用，主要是一種快速高效的水稻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

原生質(zhì)體瞬時表達(dá)是細(xì)胞功能學(xué)研究的重要操作手段。近年來，雙子葉植物擬南芥原的生質(zhì)體被廣泛用于胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制的探索、蛋白的亞細(xì)胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA與蛋白質(zhì)的相互反應(yīng)等許多領(lǐng)域。單子葉植物水稻的原生質(zhì)體的相關(guān)報道也越來越多。但由于研究起步較晚，在原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化的方法上還有很多可以改進(jìn)的地方。在過去很長一段時間內(nèi)，單子葉植物原生質(zhì)體是借助植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系分離而來的，這種方法所需周期較長，且培養(yǎng)過程中容易染菌，并不能做到瞬時、快捷。研究發(fā)現(xiàn)，以水稻幼莖，葉和葉鞘等組織為試驗材料，也可以分離出優(yōu)質(zhì)的原生質(zhì)體。但幼莖、葉及葉鞘的原生質(zhì)體形態(tài)上還有一定的差別，這些差別并沒有完全證實。此外，不管是在擬南芥、水稻還是其他植物的原生質(zhì)體分離過程中，在獲取原生質(zhì)體的過程中都采用離心的方法收集，容易混有大量的細(xì)胞碎片，會干擾后續(xù)過程中的轉(zhuǎn)化效率及其他酶促反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種快速高效的水稻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法，它能夠克服采用離心法分離原生質(zhì)體造成細(xì)胞碎片等雜質(zhì)含量高的缺陷；明確莖、葉原生質(zhì)體的形態(tài)差異；得到高純度的原生質(zhì)體；增進(jìn)轉(zhuǎn)化效率。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的。這種快速高效的水稻原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化方法，主要是根據(jù)密度梯度自沉降的方法可以不使用離心而使大小均一的細(xì)胞在合適的濃度梯度上沉淀，以及原生質(zhì)體自身可以攝取外源大分子物質(zhì)的原理，酶解水稻幼莖細(xì)胞壁獲得的原生質(zhì)體和建立高效的瞬時表達(dá)體系，該方法包括如下步驟：

（1）水稻種子去穎殼，消毒；

（2）消毒種子在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-15天，待其長成15-20cm高的幼苗；培養(yǎng)條件：25℃，光照12h，黑暗12h，光照強(qiáng)度：8000Lux；

（3）取水稻幼莖，剝?nèi)ト~鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入滲透劑，暗條件放置20-30分鐘；所述滲透劑為0.3mol/L山梨醇和50mM氯化鈣的混合液TVL；

（4）加入酶解液酶解細(xì)胞壁以獲得原生質(zhì)體；具體方法如下：在室溫22-25℃條件下，將酶解液加入的水稻幼莖和滲透劑的混合液中，真空抽濾1h；然后置于水平搖床上60r/min搖4h；

（5）用25um的尼龍網(wǎng)膜過濾酶解后的混合物，棄濾渣；濾液上層緩慢滴加等滲的W5溶液，4℃濾液靜置30min以上，待溶液分層；

（6）吸取中層10ml的原生質(zhì)體，用10mlW5溶液洗滌（100g離心5-10min，棄上清），2-3次，即獲得較為純凈的原生質(zhì)體；

（7）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：以終濃度為20%的PEG為媒介，將帶有35S驅(qū)動的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的質(zhì)粒pSTAN1轉(zhuǎn)化進(jìn)入原生質(zhì)體：轉(zhuǎn)化體系如下：10ul質(zhì)粒，100ul原生質(zhì)體用MMG溶解，110ul40%的PEG-Cacl₂；室溫放置5-15min，然后加入W5溶液至反應(yīng)體系的總體積為1ml以終止反應(yīng)；100g離心5min，去上清；再加入1ml?W5懸浮原生質(zhì)體，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)2-24小時。

所述的消毒方法如下：體積百分比為70%酒精洗30s；蒸餾水洗一次；體積百分比為50%NaClO搖洗30min；滅菌蒸餾水洗8-10次。

所述的酶解液為3%纖維素酶R-10和0.6%果膠酶R-10、1M蔗糖、pH5.7的0.2M?MES、1M二水氯化鈣、2M氯化鎂配制成的混合液，55℃溫育10min，使蛋白酶失活，冷卻后過濾除菌。

轉(zhuǎn)化時，原生質(zhì)體需預(yù)先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液懸浮，MMG由4mMMES?pH5.7，0.4M?Mannitol，15mM?MgCl₂組成，轉(zhuǎn)化采用的媒介為PEG，由40%PEG4000，0.2M?Mannitol，100mM?CaCl₂組成。