[發明專利]一種不對稱菁染料化合物及其應用

有效

• 申請號: 201310467180.X
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN103554096B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 李輝;金大智;方維佳;王堯;柯炳欣
• 申請（專利權）人: 上海輝睿生物科技有限公司;浙江省疾病預防控制中心;浙江大學
• 主分類號: C07D417/06
• 分類號: C07D417/06;C07D417/14;G01N33/52;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種在FRET中作為淬滅劑使用的化合物，更進一步而言，本發明涉及作為淬滅劑的菁染料化合物，試劑及其在FRET中的應用。

（二）背景技術

核酸雜交技術是分子生物學的基本技術之一，可以用來對遺傳疾病進行診斷，人體鑒定，微生物鑒定，親子鑒定，近年來正逐漸用于病毒的特異，敏感和快速診斷。

核酸雜交技術一個很重要的方面是對雜交的探測，一個經常使用的工具是熒光寡核苷酸探針，一種特別有用的熒光探針類型是自淬滅探針，此探針包括了報告染料和淬滅染料，二者之間通過熒光共振能量轉移（FRET）過程發生作用。盡管使用該基序的不同探針的設計可能在細節上存在差異，FRET探針含有連接到寡核苷酸上的熒光團和淬滅劑。

實時熒光定量PCR技術通過檢測PCR產物中熒光信號強度來達到定量的目的，該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已在動植物基因工程，微生物和醫學領域中得到廣泛應用。

熒光染料廣泛用于生物學研究和診斷，熒光染料優于常規的放射性材料，因為熒光染料通常具有足夠的檢測靈敏度，廉價并且無毒，具有可區分顏色范圍的各種熒光團使得能平行檢測多種生物學靶標的多重實驗更加可行，在體外和體內描述不同生物學靶標之間在空間和時間上的關系常要求能平行顯示多個靶標。此外，大量熒光染料為進行高通量和自動化試驗打開了新的通道。而在基于DNA的FRET檢測中，FAM以其完美匹配的光源，廉價的成本，高度的穩定性，較高的量子產率成為各種檢測中最常用的報告染料，特別是在實時熒光定量PCR技術中的應用更加廣泛。

而作為與FAM相匹配的淬滅基團，目前大部分為偶氮染料淬滅劑，即暗淬滅劑，這類淬滅劑不占據發射帶寬。并且大部分能夠多路復用。一種典型的暗淬滅劑是DABCYL（4-[[4-（二甲氨基）-苯基]-偶氮基]-苯甲酸），它常常與分子信標聯用。DABCYL在380～530nm的范圍內淬滅染料。因此，即使具有較長發射的熒光團（例如Cy3-染料）也可被DABCYL更好的淬滅。然而，DABCYL具有不適當的吸收譜帶，與在488nm以上發射的熒光團的重疊非常差。又一種非熒光染料為Eclipse淬滅劑（4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺，Epoch?Biosciences，Inc.）它在530nm處吸收最大，并且有效淬滅從520nm到670nm的光譜。

對上述暗淬滅劑的一種改進為Black?Hole淬滅劑，例如BHQ-1([4-(2-硝基-4-甲基-苯基)-偶氮基]-基-（（2-甲氧基-5-甲基-苯基）-偶氮基）)-苯胺）（為Biosearch?Technologies，Inc.），它能夠淬滅可見光譜，這些非熒光常用作熒光受體的替代物，目的是為了降低背景熒光并以此提高靈敏度。

然而，已知的非熒光淬滅劑的缺點是其淬滅功效不足，這導致了高背景信號，進而又導致了信號動力學特征受到限制。

（三）發明內容

本發明的目的是提供新的淬滅劑，其具有低背景信號和/或高淬滅功效。本發明提供一種不對稱菁染料的熒光淬滅劑化合物，可有效淬滅FAM的熒光，令人意想不到的是，而且此種菁染料化合物顯示出與未淬滅前相似的與DNA結合的功效，即可以穩定DNA雙鏈，這樣就可以PCR過程中解鏈溫度增加，即Tm值升高。

本發明涉及下式I的化合物：

一種不對稱菁染料化合物，其結構如式（I）所示：

式（I）中：

R₁為-H、-NO₂、-OH或C1～C4烷基；

R₂為-H、C1～C4烷基、苯基或鹵素取代苯基；

R₃、R₄為-H、C1～C4烷基或活性基團，并且R₃、R₄中至少一個為活性基團。

所述活性基團是指可以與其它化學基團反應而形成共價化學鍵的基團，在合適的反應條件下具有共價活性，是與其它底物連接的點，包括親電、親核和光活性基團。

本發明化合物是具有化學活性和可以被至少一個活性基團取代的，活性基團的功能是作為連接其它部分的位點，此處活性基團與載體或者固相支撐物上的合適的活性基團進行化學反應。