[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)BRAF基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310466109.X
• 申請(qǐng)日: 2013-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN103571948A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳剛;葉倫;李雪梅;付金玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢康錄生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)BRAF基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

BRAF基因位于7q34，長(zhǎng)約190kb，轉(zhuǎn)錄mRNA長(zhǎng)2.5kb，編碼783個(gè)氨基酸的蛋白。BRAF蛋白由783個(gè)氨基酸組成，功能上從N端到C端為RAS結(jié)合區(qū)、富含半胱氨酸區(qū)(Cys)、甘氨酸環(huán)(Gloop)和激活區(qū)。在絕大多數(shù)組織和細(xì)胞類型中，BRAF是MEK/ERK最為關(guān)鍵的激活因子。它主要有CR1、CR2和CR3三個(gè)保守區(qū)，其中CR1區(qū)含RBD區(qū)(ras?banding?domain，為RAS蛋白結(jié)合區(qū))和富含半胱氨酸區(qū)(Cys)；CR3區(qū)為激酶結(jié)構(gòu)域，含甘氨酸環(huán)(Gloop)，為ATP結(jié)合位點(diǎn)和激活區(qū)，該區(qū)T598和S601兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化對(duì)BRAF蛋白的激活至關(guān)重要。BRAF蛋白的主要磷酸化位點(diǎn)為S364、S428、T439、T598和S601。BRAF蛋白的完全活化需要T598和S601兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，這兩個(gè)位點(diǎn)氨基酸的置換將導(dǎo)致激酶持續(xù)性激活。?

研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF突變。BRAF突變主要有兩種類型：1.11%位于exon11上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468等的點(diǎn)突變；2.89％的突變發(fā)生在exon15上的激活區(qū)，其中約92％位于第1799核苷酸上，T突變?yōu)锳(T1799A以前認(rèn)為是T1796A)，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E以前被認(rèn)為是V599E)。此外，僅不到1％的癌組織同時(shí)存在BRAF突變與RAS突變，且在這1％中，BRAF突變幾乎均為非V600E突變。以上兩種類型的突變均能使BRAF激酶活性及NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力提高，但以后者更為重要。V600E突變能模擬T598和S601兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。?

目前用于基因突變檢測(cè)的方法有Sanger測(cè)序法、高效液相色譜法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。Sanger基因測(cè)序技術(shù)經(jīng)過了30年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經(jīng)可以對(duì)長(zhǎng)達(dá)1,000bp的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，而且對(duì)每一個(gè)堿基的讀取準(zhǔn)確率?高達(dá)99.999%。由于具有很高的讀取準(zhǔn)確率，Sanger法測(cè)序成為基因突變、單核苷酸多態(tài)性等基因分析的金標(biāo)準(zhǔn)。?

腫瘤組織中，BRAF野生型細(xì)胞與突變型細(xì)胞混雜，而Sanger測(cè)序法的靈敏度僅為10～20%，即當(dāng)突變型細(xì)胞占整體檢測(cè)細(xì)胞的10～20%時(shí)才能檢出，因此而極大的限制了Sanger測(cè)序法的應(yīng)用。?

肽核酸（peptide?nucleic?acids，PNA)一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對(duì)的形式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠(yuǎn)優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補(bǔ)DNA具有1個(gè)堿基不匹配時(shí)，其溶解溫度會(huì)下降8℃～20℃，2個(gè)堿基不匹配時(shí)則完全不能雜交。鑒于上述諸多DNA分子不具備的優(yōu)點(diǎn)，近十年來，人們?yōu)槠湓谠S多高技術(shù)領(lǐng)域找到了用途。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測(cè)BRAF基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明采用PNA鉗夾技術(shù)封閉野生型BRAF基因序列，從而提高檢測(cè)BRAF基因熱點(diǎn)突變的敏感度和突變檢出率。?

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：?