[發明專利]一種用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液及其制備方法

在審

• 申請號: 201310462847.7
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN104208662A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 范超杰;李建正;陳建暉
• 申請（專利權）人: 鄭州后羿制藥有限公司
• 主分類號: A61K38/21
• 分類號: A61K38/21;A61K9/08;C07K14/56;C07K1/14;A61P31/14;A61P31/20;A61P31/22;A61P35/00;A61K36/481
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：包括以下重量份數的原料：黃芪提取液2～4份、雞α-干擾素注射液6～8份。

2.根據權利要求1所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：所述黃芪提取液是由以下方法制備的：

1）將黃芪粉碎至顆粒粒徑為250～300μm，按照黃芪與水的質量比為1:6～10的比例將黃芪浸于蒸餾水中，在60～75℃條件下進行恒溫微波提取，得混合物A；

2）將混合物A進行離心分離，取上清液，用活性炭進行脫色，得混合物B；

3）將混合物B濃縮至比重為1.15～1.25，得混合物C；

4）向混合物C中加入6～8倍體積量的乙醇溶液，攪拌使其混合均勻后，進行離心分離，取沉淀物并用蒸餾水稀釋至比重為1.05～1.15，得混合物D；

5）將混合物D進行凝膠層析，收集吸收峰為280nm的層析后洗脫液，即得黃芪提取液。

3.根據權利要求2所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：步驟1）中所述微波提取的功率為250W，重復提取3～4次，每次提取時間為11～15min。

4.根據權利要求2所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：步驟2）中所述離心分離的轉速為3000～5000rpm，時間為12～16min；步驟4）中所述離心分離的轉速為3000～5000rpm，時間為12～16min。

5.根據權利要求2所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：步驟4）中所述乙醇溶液中乙醇的質量分數為70%～95%。

6.根據權利要求2所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：步驟5）中所述凝膠層析所用凝膠為葡聚糖凝膠，層析柱的內徑與高度比為1:30～50；所述凝膠層析的洗脫液為蒸餾水，流速為0.3～0.6ml/min。

7.根據權利要求1所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：所述雞α-干擾素注射液是由以下方法制備的：

a.取含有重組雞α-干擾素蛋白的菌液，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌后，再用PBS緩沖液重懸，超聲使菌體破壁后，離心并收集沉淀物；

b.將步驟a所得沉淀物用PBS緩沖液洗滌后，用變性緩沖液溶解包涵體，離心收集上清液，得變性蛋白溶液；

c.將步驟b所得變性蛋白溶液加入復性緩沖液中，4℃靜置48h后，離心收集上清液，得含有重組雞α-干擾素蛋白的溶液；

d.從重組雞α-干擾素蛋白的溶液中收集重組雞α-干擾素蛋白，進行蛋白處理后，加入保護劑溶液進行混合，使重組雞α-干擾素的含量為10⁸～10⁹IU/100ml，即得雞α-干擾素注射液。

8.根據權利要求7所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：所述變性緩沖液的pH為8.5，含有6mol/L鹽酸胍、2mmol/L?EDTA、50mmol/L?Tris·Cl、10mmol/L?DTT；所述復性緩沖液的pH為8.0，含有0.5mol/L?L-Arg、2mmol/L?EDTA、體積分數為20%的甘油、0.9mmol/L?GSSG、0.1mol/L?Tris·Cl。

9.根據權利要求7或8所述的用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液，其特征在于：所述含有重組雞α-干擾素蛋白的菌液是由以下方法制備的：

i）菌體培養階段：將發酵培養基高溫滅菌后，加入1ml、濃度為100mg/ml的Amp，按體積百分比為5%～10%的量接入含有重組雞α-干擾素蛋白的發酵用種子液，37℃培養8～10h，培養過程中維持pH為7.2，當碳源消耗完后菌體不再生長，溶氧上升至30%，補加發酵培養基；

ii）碳源飼喂階段：碳源消耗完后，流加補料培養基，使溶氧維持在30%以上，培養過程中維持pH為7.2；

iii）誘導表達階段：繼續流加補料培養基，加入IPTG至終濃度為0.5mM，誘導表達目的蛋白，培養過程中維持pH為7.2，溶氧維持在30%以上，誘導4h，得發酵液，即為含有重組雞α-干擾素蛋白的菌液。

10.一種用于治療禽類病毒性疾病的復方注射液的制備方法，其特征在于：包括下列步驟：

A.制備黃芪提取液：

1）將黃芪粉碎至顆粒粒徑為250～300μm，按照黃芪與水的質量比為1:6～10的比例將黃芪浸于蒸餾水中，在60～75℃條件下進行恒溫微波提取，得混合物A；

2）將混合物A進行離心分離，取上清液，用活性炭進行脫色，得混合物B；

3）將混合物B濃縮至比重為1.15～1.25，得混合物C；

4）向混合物C中加入6～8倍體積量的乙醇溶液，攪拌使其混合均勻后，進行離心分離，取沉淀物并用蒸餾水稀釋至比重為1.05～1.15，得混合物D；

5）將混合物D進行凝膠層析，收集吸收峰為280nm的層析后洗脫液，即得黃芪提取液；

B.制備雞α-干擾素注射液：

a.取含有重組雞α-干擾素蛋白的菌液，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌后，再用PBS緩沖液重懸，超聲使菌體破壁后，離心并收集沉淀物；

b.將步驟a所得沉淀物用PBS緩沖液洗滌后，用變性緩沖液溶解包涵體，離心收集上清液，得變性蛋白溶液；

c.將步驟b所得變性蛋白溶液加入復性緩沖液中，4℃靜置48h后，離心收集上清液，得含有重組雞α-干擾素蛋白的溶液；

d.從重組雞α-干擾素蛋白的溶液中收集重組雞α-干擾素蛋白，進行蛋白處理后，加入保護劑溶液進行混合，使重組雞α-干擾素的含量為10⁸～10⁹IU/100ml，即得雞α-干擾素注射液；

C.取步驟A所得黃芪提取液2～4重量份、步驟B所得雞α-干擾素注射液6～8重量份進行混合，即得。