[發明專利]VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株及其制備方法

有效

• 申請號: 201310456112.3
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525777A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 朱啟運;吉艷紅;付鈺廣
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/45;C12N15/63;A61K39/17;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京鑫浩聯德專利代理事務所(普通合伙) 11380
• 代理人: 呂愛萍

1.?一種VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株，其特征在于：該VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株毒力明顯減弱，同時在雞胚上具有高滴度、遺傳性能穩定、與流行病毒的抗原匹配性高，適合于疫苗的大規模生產，可用于制造疫苗，該VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的抗原核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:4所示。

2.一種VII型新城疫病毒L基因突變的減毒疫苗株的制備方法，其特征在于：構建了覆蓋整個基因組的五個cDNA克隆片段，利用各片段間重疊部分的酶切位點，在轉錄載體質粒pBR322連接組裝獲得了15192nt的完整cDNA克??；在全長cDNA片段的5’末端前綴T7RNA聚合酶啟動子，在cDNA片段后加入具有自我催化功能的丁肝病毒核酶（RiB）和T7轉錄終止信號，構建好的質粒命名為prNDV-97；通過PCR基因組將基因組cDNA中的L蛋白編碼區第14056位堿基由A同義突變為G，消除14056bp處的Hind?Ⅲ酶切位點，并作為拯救病毒的分子標記，構建完成的質粒命名為pmNDV-97；同時在T7聚合酶啟動子于基因組cDNA的5’末端引入兩個多余的G，有助于副粘病毒反向遺傳操作的病毒拯救；

設計5對引物用于擴增NDV?Ⅶ-97株基因組SEQ?ID?NO:5，引物序列如下：

F1：5'ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCTG

TGAGGTACGATAA3'

R1：5'TAGGTACCCTTGCAGTGGCAGACTTAATCAATTCAGAG3'

F2：5'GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTCACA3'

R2：5'ATGGTACCCTCCCTGTTGCAGATGTCCGAAGCACACCA3'

F3：5'TGCAGAGATCACTCACACTCACATCAATAC3'

R3：5'ACGGTACCAGGTGACCAGCTTCTGTTTCGGGCATAATC3'

F4：5'ATTAGTTTCTTCCAATATGTGCTCGCTGAC3'

R4：5'GTAGTAATGATACAGACCTGTAGGGTACCA3'

F5：5'GGAGAGAGAATGCAGAAGAAAGTGACCTGACCTCAGATAAAGCAG3'

R5：5'AGCCGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAAACAG

AGATTTGGTGAATGACATC3'

設計2對用于突變14056bp處Hind?III酶切位點引物，消除此酶切位點，引物序列如下：?

AFa：5'?CATGTTTTAAAGTTGTCAAG?3'

F6：5'?GGGTCCAATCAGAGCTTATTAGATC?3'

R6：5'?GATCTAATAAGCTCTGATTGGACCC?3'

ARa：5'?GCG?GTCGAC?ACCGCTTTCAGGTATTTAG3'；

在pmNDV-97全基因組質粒的基礎上，構建NDV-97?L基因突變減毒株，具體操作為：

通過下列引物，分別經Overlapping?PCR方法，將NDV親本毒L蛋白結構域Ⅵ內的1756、1917和1954位氨基酸分別單點突變，將擴增后的目的片段和pmNDV-97載體經Hind?Ⅲ和XbaⅠ限制性內切酶分別雙酶切，進行核酸電泳，膠回收目的片段和載體pmNDV-97后進行連接，所獲得的突變質粒分別命名為pK1756A、pK1917A和pE1954Q；

設計4對引物用于NDV?Ⅶ-97?L蛋白氨基酸定點突變，引物序列如下：

AF1：5'?CATGTTTTAAAGTTGTCAAG?3'

AF2：5'?CTTCTTGGTATGCGGCATCTCATCTTC?3'

AF3：5'?GTAGTGATCATCGCAGTACTGTATGC3'

AF4：5'?GAGGGGATATGCAATGTTACCTGATAT3'

AF5：5'?GCG?GTCGAC?ACCGCTTTCAGGTATTTAG3'??

AF6：5'GAAGATGAGATGCCGCATACCAAGAAG3'

AF7：5'GCATACAGTACTGCGATGATCACTA3'

AF8：5'ATATCAGGTAACATTGCATATCCCCT3'

其中，AF1+AF6、AF1+AF7和AF1+AF8引物利用PCR方法分別擴出目的條帶，分別命名為A1、B1和C1；AF5+AF2、AF5+AF3和AF5+AF4引物利用PCR方法分別擴出目的條帶，分別命名為A2、B2和C2；在此基礎上，利用AF1+AF5引物分別經Overlapping?PCR方法，以A1+A2、B1+B2和C1+C2分別為模板，擴增約6000bp（含突變位點）的目的片段，分別獲得L突變片段L1756、L1917和L1954。