[發(fā)明專利]檢測MLH1基因第12外顯子突變的引物、方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310451847.7
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103555826A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋坤;周曉犢;王淑一;孫翠蓮
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥艾迪康臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是針對MLH1基因第12外顯子突變的引物、方法和試劑盒。可用于MLH1基因突變與遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC）相關(guān)性檢測。

背景技術(shù)

大腸癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，也是腫瘤病因性死亡率的較高的癌癥。遺傳性非息肉病性大腸癌(herediary?nonpolyposis?colorectal?cancer,HNPCC)，又稱Lynch綜合癥，是一種常染色體顯性遺傳性疾病，其特征為發(fā)病較早，具有家族聚集性，并可能伴發(fā)其他腫瘤。其發(fā)生與家族中存在錯配修復(fù)基因遺傳性突變直接相關(guān)，且主要發(fā)生在MLH1基因，以及其他相關(guān)基因，如MSH2、MSH6、APC、MYH和PMS2等。

篩查是早期發(fā)現(xiàn)大腸癌、降低致死率的有效方法。Lynch等對HNPCC監(jiān)測處理的經(jīng)驗是：(1)突變基因攜帶者從20～25歲起進行結(jié)腸鏡檢查，每1～2年1次，35歲以后1年1次；(2)HNPCC患者應(yīng)進行結(jié)腸次全切除術(shù)，并且在結(jié)腸次全切除后，還應(yīng)對其隨防終生；(3)女性患者應(yīng)預(yù)防性切除子宮、卵巢、輸卵管。

MLH1基因位于染色體3p21-23上，其DNA全長約58kb(不包括啟動子),含19個外顯子,它的cDNA為長2268bp的開放閱讀框(ORF),編碼長為756個氨基酸的蛋白。MLH1的突變是另一個研究熱點,主要為錯義突變和堿基的缺失或插入造成的移碼突變和雜合性缺失，導(dǎo)致MLH1蛋白序列改變而使腫瘤發(fā)生。目前國內(nèi)已有關(guān)于MLH1基因第1外顯子、第2外顯子、第19外顯子若干堿基突變的報道及相關(guān)專利。MLH1第12外顯子1151處的T→A突變在東亞正常人群中有一定的發(fā)生率，對于HNPCC風險評估具有重要的指導(dǎo)意義。

另外，所有HNPCC患者均應(yīng)接受遺傳咨詢：不僅對HNPCC家族先證者進行錯配修復(fù)基因遺傳性突變篩查，而且可以對患者家族其他成員進行遺傳咨詢，此外也可以對尚未出現(xiàn)腫瘤的年輕成員進行風險評估和早期診斷，對其中的基因突變攜帶者做到早診斷早治療早干預(yù)。

檢測樣品中是否存在MLH1基因突變的引物，可用于對個體的HNPCC易感性進行診斷，通過對檢測樣本的MLH1基因第12外顯子進行檢測，以此來判斷是否與普通人群存有差異，進而判斷該個體患HNPCC的風險是否高于普通人群。攜帶突變基因型的個體患HNPCC的風險顯著高于普通人群，應(yīng)當進一步對其家族進行檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種檢測檢測MLH1基因突變的引物，其特征在于，包括用于擴增樣本DNA中MLH1基因第12外顯子的PCR引物，其序列為：

EXON12F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA

EXON12R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。

進一步地，測序的通用引物M13為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

進一步地，所述的MLH1基因突變是MLH1基因第12外顯子1151處T→A突變。

本發(fā)明還提供，一種檢測MLH1基因突變的方法，包括如下步驟：

1）采集待測血液樣本，提取DNA；

2）以步驟1中所提取的DNA為模板，利用擴增樣本DNA中MLH1基因第12外顯子的PCR引物進行擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，所述擴增樣本DNA中MLH1基因第12外顯子的PCR引物為：

EXON12F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA

EXON12R：AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。

3）對步驟2中所得PCR擴增產(chǎn)物進行測序，與MLH1基因野生序列進行比較，確定是否存在MLH1基因第12外顯子1151處的T→A突變，測序的通用引物M13為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

進一步地，PCR擴增反應(yīng)條件如下：步驟1：94℃，2min；步驟2：98℃10sec,66℃30sec,68℃40sec，共16個循環(huán)，而且每循環(huán)一次，Tm溫度會遞減0.5℃，16個循環(huán)后最終Tm為58℃；步驟3：98℃10sec，58℃30sec,68℃40sec，共20個循環(huán)；步驟4：68℃6min；步驟5：4℃保存。