[發(fā)明專利]一種檢測(cè)乙肝病毒核酸試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310446194.3
• 申請(qǐng)日: 2013-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN103468829A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓勇軍;劉琪琦;林曉云;李洪強(qiáng);李洪生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京普利耐特生物科技有限公司;中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京瑞思知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11341
• 代理人: 李濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)乙肝病毒核酸試劑盒。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒（HBV）感染是導(dǎo)致肝硬化和干細(xì)胞癌的主要原因之一。HBV感染者血漿（清）中HBV核酸是了解肝內(nèi)HBV復(fù)制水平、HBV感染診斷、療效監(jiān)控和指導(dǎo)用藥的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確靈敏的定量檢測(cè)血清中HBV核酸對(duì)乙型肝炎治療效果的監(jiān)測(cè)具有極其重要意義。目前，熒光定量PCR法檢測(cè)HBV核酸現(xiàn)是檢測(cè)乙肝病毒復(fù)制最常用的手段。

盡管我國HBV核酸定量試劑質(zhì)量得到很大改進(jìn)，但多數(shù)試劑的靈敏度、準(zhǔn)確度及重復(fù)性等與進(jìn)口優(yōu)質(zhì)試劑相比，仍存在較大差距。國際主流HBV核酸定量試劑，如Roche定量試劑的檢測(cè)下限為12～20IU/ml。而目前我國市場(chǎng)上主流的國產(chǎn)HBV核酸定量檢測(cè)下限一般為500～1000IU/ml，不能滿足臨床診斷需求。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于復(fù)合探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒核酸的試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一對(duì)寡核苷酸探針，其熒光探針序列是：5′-FAM-ATCACCACCATCTGGTTTCACCCGGAC-P-3′；淬滅探針序列是：5′-GAAACCAGATGGTGGTGA-Dabcyl-3′。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)乙肝病毒核酸的試劑盒，該試劑盒包括含有上述寡核苷酸探針的PCR反應(yīng)液A。

上述PCR反應(yīng)液A還包括用于監(jiān)測(cè)體系的內(nèi)標(biāo)探針，該內(nèi)標(biāo)探針序列是：5′-HEX-TCCATTACACGTGAACGATTCCCCA-TAMRA-3′。

上述PCR反應(yīng)液A還包括含有Mg2+，dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP，甲酰胺，Tris-HCl，KCl，Tween20的PCR反應(yīng)緩沖液；靶基因正向引物、反向引物；內(nèi)標(biāo)的正向引物、反向引物。

其中，所述PCR反應(yīng)液中的靶基因擴(kuò)增的引物的是：

正向引物5′-CGTCTCGAGCAACTATACTGT-3′

反向引物5′-CACCGGTCGTGCACAGTATC-3′。

其中，所述監(jiān)測(cè)體系的內(nèi)標(biāo)引物是：

正向引物5′-GCCTTTCATTGGCATGACCACCTTTCAT-3′

反向引物5′-AGCCAGTCGTCATAATCGCATT-3′。

上述用于檢測(cè)乙型肝炎病毒核酸的試劑盒還包括樣本處理液A，樣本處理液B，內(nèi)標(biāo)，PCR反應(yīng)液B，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，定量參考品。

其中，所述樣品處理液A是7%PEG6000；

樣品處理液B包含NaOH，TritonX-100，NP40，Tris-HCL；

PCR反應(yīng)液B包含Taq酶和UNG酶；

陰性質(zhì)控品是正常血清；

陽性質(zhì)控品是含HBV核酸的重組DNA片段；

定量參考品是含HBV核酸的重組DNA片段；

內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品是含熒光素酶的重組DNA片段。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述試劑盒在快速檢測(cè)乙型肝炎病毒上的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，包括下列步驟：

1）用樣本處理液A和B進(jìn)行陰、陽性質(zhì)控品以及利用磁珠法分離待測(cè)樣本的DNA。

2）將提取的DNA加入到含有PCR反應(yīng)液A和PCR反應(yīng)液B的PCR反應(yīng)管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：

1）高靈敏度，最低檢測(cè)濃度為50IU/ml；

2）全封閉反應(yīng)，提取病毒DNA后，直接用于PCR檢測(cè)，避免了污染發(fā)生；

3）檢測(cè)速度快，整個(gè)過程不超過2小時(shí)；

4）操作簡(jiǎn)單，可控性強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)，有利于產(chǎn)業(yè)化；

5）PCR反應(yīng)體系中加有內(nèi)標(biāo)，具有防止假陰性等優(yōu)點(diǎn)。

6）加有防污染體系，具有防止產(chǎn)物污染的作用。

可見，該試劑盒通過對(duì)樣本中的乙型肝炎病毒核酸進(jìn)行定性定量檢測(cè),由于其具有高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒感染的輔助診斷。

附圖說明

圖1是顯示工作標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線。其中，（1）是各標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線，（2）是各標(biāo)準(zhǔn)品線性相關(guān)關(guān)系圖。

圖2是顯示陰性質(zhì)控品品質(zhì)鑒定圖。其中，（1）說明檢測(cè)過程中沒有乙型肝炎病毒核酸的污染,實(shí)驗(yàn)過程能正常擴(kuò)增，（2）內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，說明檢測(cè)體系有效擴(kuò)增。