[發明專利]一種雙層平板及其制備方法

有效

• 申請號: 201310441319.3
• 申請日: 2013-09-25
• 公開（公告）號: CN103540519A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 劉學端;梁伊麗;尹華群;恩剛姆;胡琪;馬麗媛;肖云花;邱冠周
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12N1/16;C12R1/72
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明屬于浸礦微生物篩選的產品技術領域，具體涉及一種用于浸礦微生物篩選的雙層平板及其制備方法，和菌株。?

背景技術

生物冶金利用微生物氧化硫化礦等礦物中的鐵和硫，使結合在礦石中的有價金屬釋放到溶液中以利于進一步提取。浸礦微生物主要包括自養的鐵氧化菌和硫氧化菌，它們利用硫化礦中的Fe^2＋或者還原型的硫化物（如黃鐵礦Fe₂S）作為能源生長，產生硫酸促進硫化礦的浸出，因此，篩選出高效浸礦微生物是生物冶金的關鍵。?

固體培養基通常用于浸礦微生物的分離和培養,然而浸礦微生物主要是自養菌，瓊脂等凝固劑中的有機物質及其水解產物對浸礦微生物生長有抑制作用，酸性的固體培養基難以制作，所以浸礦微生物通常難以在固體平板上產生大量有特色的菌落供菌株篩選、選育及遺傳特性研究。因此，高活性的浸礦微生物菌種資源缺乏，浸礦機理不明，導致生物浸出技術浸出速率慢，限制其大規模工業化應用。?

為提高浸礦微生物檢出率并縮短培養周期,雙層平板方法發明并用于該類微生物的分離篩選。雙層平板中采用底層涂布嗜酸的(Candida?digboiensis?sp.)等異養菌以除去培養基中的有毒有機物質,上層用于化能自養菌的篩選。雙層平板中的培養基成分也不斷改進，但目前該方法仍存在很大挑戰。?

本發明篩選了一種嗜酸酵母，利用其設計了一種新型的分離純化極端浸礦菌的雙層平板，該酵母菌除去培養基中的有毒有機物質的作用明顯，成功的實現了浸礦菌的固體平板培養及純化。?

發明內容

本發明的目的是通過篩選酸性浸礦體系中的嗜酸酵母，提供一種利用該菌建立的快速篩選浸礦微生物的雙層平板及其制備方法，以豐富浸礦微生物資源,成功的實現浸礦菌的固體?平板培養及純化。?

一種雙層平板，是在雙層培養基平板的底層平板中接種有嗜酸酵母(Candida?digboiensisZBY)，所述的嗜酸酵母(Candida?digboiensisZBY)的保藏編號為:CCTCC?NO：M2013311。?

所述的雙層平板的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：?

1）挑選嗜酸酵母(Candida?digboiensisZBY)單菌落置于含1wt%的葡萄糖和0.025wt%的胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）的5mL9k液體培養基中活化至菌液濃度達到10⁹個/mL以上，取占體積比10%的活化好的培養液加入含1%葡萄糖的9K液體培養基中，得到酵母菌培養液；?

2）分別配制以下三種溶液：(a)pH=2.0的2×9K液體培養基（即培養基中，每種成分的濃度均為2倍），(b)pH=2.0的250mM的硫酸亞鐵溶液，其中含10mM?K₂S₄O₆；(c)pH=4.5的3wt％瓊脂糖溶液；50℃時將(a)(b)(c)三種溶液按體積比4：1：5混合，制備成分離和純化用培養基2份；?

3）其中1份立即接種步驟1）得到的酵母菌培養液，接種量為培養基體積比的1%，然后傾倒在無菌培養皿中形成凝膠，另一份保溫，當培養皿內的凝膠凝固，再倒入第二份無酵母的培養基，制成雙層平板。?

所述的酵母菌為嗜酸酵母(Candida?digboiensisZBY)，保藏編號為:CCTCC?NO：M2013311。保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址：中國.武漢.武漢大學，保藏日期：2013年7月2日。?

本發明篩選了一種嗜酸酵母，利用其設計了一種新型的分離純化極端浸礦菌的雙層平板，該酵母菌除去培養基中的有毒有機物質的作用明顯，成功的實現了浸礦菌的固體平板培養及純化。?

附圖說明

圖1為酵母(Candida?digboiensisZBY)顯微形態；?

圖2為本發明利用酵母(Candida?digboiensisZBY)制作的雙層平板；?

圖3為本發明雙層平板篩選的浸礦微生物菌落形態和掃描電子顯微鏡照片（SEM）圖像；?

（a）底層接種酵母，上層接種浸礦微生物的雙層平板；?

（b）Z1菌的SEM圖像；?

（c）Z2菌的SEM圖像。?

具體實施方式

以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。?

實施例1嗜酸酵母(Candida?digboiensisZBY)的分離篩選和鑒定:?