[發明專利]高油酸花生分子標記及其輔助選擇回交育種方法和應用

有效

• 申請號: 201310434389.6
• 申請日: 2013-09-23
• 公開（公告）號: CN103468678A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 張新友;齊飛艷;黃冰艷;劉華;韓鎖義;湯豐收;董文召;徐靜
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A01H1/02;A01H1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種高油酸花生分子標記，其特征在于，所述分子標記在花生ahFAD2B位點的變異特異引物序列分別為：

正向引物MITE-INS-F：GGATGATGGATTGTATGG，

反向引物MITE-INS-R：CTCTGACTATGCATCAG；

在花生ahFAD2B位點無變異特異引物序列分別為：?

正向引物WILD-F為：CAGAACCATTAGCTTTG，

反向引物WILD-R為：CTGAGACATAAATTAGAAGCC。

2.利用權利要求1所述的分子標記進行高油酸花生的回交育種方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）將基因型AABB的普通油酸含量的花生親本，與基因型aabb的高油酸含量的花生親本雜交，得到后代F₁；

（2）以后代F₁做父本，與基因型AABB的花生親本回交，得到后代BC₁F₁；

（3）提取后代BC₁F₁單株的DNA，利用花生基因組中的一對引物擴增FAD2A基因片段，其中正向引物aF19為：GATTACTGATTATTGACTT，反向引物R3為：CCCTGGTGGATTGTTCA，

擴增后測序，選擇含Aa基因型的單株；

然后利用所述花生ahFAD2B位點的變異特異引物和無變異特異引物作為標記分別對含Aa基因型的單株進行PCR檢測，選擇Bb基因型的單株；將兩個標記均顯性即含AaBb基因型的BC₁F₁單株繼續與親本AABB回交，得到后代BC₂F₁；

（4）提取后代BC₂F₁單株的DNA，按照步驟（3）的方法進行引物擴增和PCR檢測，將兩個標記均顯性即AaBb基因型的BC₂F₁單株繼續與優良親本AABB回交，得到后代BC₃F₁；

（5）提取后代BC₃F₁單株的DNA，將兩個標記均顯性即含AaBb基因型的BC₃F₁植株進行自交，按照步驟（3）的方法進行引物擴增和PCR檢測，從后代中選擇基因型為aabb的高油酸含量的單株，即得到所述的高油酸花生品種。

3.如權利要求2所述的回交育種方法，其特征在于：所述普通油酸含量花生親本的油酸含量<55%，高油酸含量的花生親本油酸含量>70%。

4.如權利要求2所述的回交育種方法，其特征在于：其中利用FAD2A引物的擴增步驟為：

（1）PCR反應體系：PCR反應體系總體積為50?μL，包括10×buffer?5?μL、2?mmol?L^–1?dNTPs?5?μL、25?mmol?L^–1?MgSO₄?3?μL、10?μmol?L^–1的正向引物和反向引物引物各1.5?μL、模板DNA?200?ng、La?Taq酶1?U；

（2）?PCR反應條件：94℃預變性5?min；94℃變性30?s，50.9℃退火30?s，72℃延伸45?s，30次循環；最后72℃延伸10?min。