[發明專利]六味地黃制劑中葡萄糖二酸鹽及葡萄糖二酸1,4內酯含量測定方法

有效

• 申請號: 201310431091.X
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103698416A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 謝寶剛;張寧寧;姚艷琴
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及藥物分析領域，特別涉及六味地黃系列制劑中葡萄糖二酸鹽及葡萄糖二酸1，4內酯的含量測定方法。

背景技術

六味地黃丸由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓等6味中藥按一定的比例配伍而成，已有幾百年的臨床應用歷史，是中醫藥的經典名方。隨著臨床研究的不斷深入,其主治亦由原來的兒科用藥拓展到內、外、婦、兒、五官等各科,涉及病癥已達40?余種，特別對復雜慢性疾病等有較好的療效。由于該成藥療效確切，幾乎沒有不良反應報道，且價格低廉等因素，深受大眾青睞。目前，在國內約有上百家廠家生產六味地黃產品，主要有湯劑、丸劑、口服液和膠囊劑等；有幾十個六味地黃品牌，年銷售額超過10億元，有著良好的社會效益和經濟效益。

應用化學和藥理相結合、血清藥物化學等方法對六味地黃丸的藥理活性成分，入血及體內代謝成分等進行了較為深入的研究，分離制得了一些有生物活性的多糖或小分子代謝產物，取得了可喜的成績。代謝組學(metabonomics)是繼基因組學、轉錄物組學和蛋白質組學后出現的新的‘組學’技術，主要對生物體在病理生理刺激的條件下,在不同時間、多方位定量檢測其代謝物含量的變化,來探討干預物對機體的調控機制的學科。近年來，代謝組學在發現與疾病診斷、治療相關的代謝標記物研究、藥物藥效及毒性評價、作用機制等方面均有著廣泛的應用，顯示出巨大的潛力。我們在基于HPLC-UV代謝組學特征色譜峰鑒定的基礎上，通過對4個特征色譜峰的相對變化關系，推測六味地黃丸可能影響大鼠體內β-葡萄糖醛酸苷酶的活性。經體內外實驗證實六味地黃丸具有明顯的β-葡萄糖醛酸苷酶抑制作用，從而發現了六味地黃丸的一個作用靶點——β-葡萄糖醛酸苷酶。在此基礎上，通過逐步分離六味地黃丸化學成分及體外酶活性測定相結合的方法，發現和鑒定了六味地黃丸中的一種新的藥理活性成分－葡萄糖二酸1，4內酯。文獻研究（Charles?B.S.,Journal?of?Orthomolecular?Medicine?Vol.?16,?No.?2,?2001）表明該物質（包括其前體葡萄糖二酸鹽）具有廣泛的包括抗癌及雌激素相關的藥理作用，之前，該化合物未有在中草藥中被發現的報道，因此，未有葡萄糖二酸鹽及其內酯在中草藥含量測定方法的報道。

雖然葡萄糖二酸鹽被發現存在于水果如蘋果和葡萄及少量的蔬菜中，迄今為止，未見利用HPLC-HILIC-UV/ELSD及HPLC-MS/MS技術對他們進行定量測定的報道。

發明內容

本發明的主要目的是對六味地黃系列制劑中的新發現成分葡萄糖二酸鹽及葡萄糖二酸1，4內酯應用多種分離檢測技術如HPLC-HILIC-UV/ELSD/MS進行定量分析。

葡萄糖二酸鹽及葡萄糖二酸1，4內酯結構式如下：

本發明具體方案如下：

稱取一定量的六味地黃制劑，加入一定體積的60%甲醇溶液，超聲20min，離心，沉淀再用等體積上述溶液提取一次，離心，合并上清液；所得上清液直接用?MS或HPLC-MS技術進行分析；葡萄糖二酸鹽特征分子負離子離子峰為209，191，85；葡萄糖二酸1，4內酯特征分子負離子離子峰為191，85；色譜保留時間、質譜圖與標準品一致。

六味地黃制劑中葡萄糖二酸鹽及葡萄糖二酸1,4內酯含量測定方法，包括：

1）葡萄糖二酸鹽和葡萄糖二酸1，4內酯標準溶液的制備：分別精密稱取葡萄糖二酸鹽和葡萄糖二酸1，4內酯兩種對照品40.0mg，定量轉移至10.0mL容量瓶中，加水稀釋到刻度，精密移取5.0mL至10.0mL容量瓶中，加80%乙腈稀釋至刻度，配制成200.0ug/mL溶液，作為對照品母溶液；

2）HPLC-HILIC-UV/ELSD法測定六味地黃丸中總葡萄糖二酸鹽的含量：