[發(fā)明專利]一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310430440.6
• 申請(qǐng)日: 2013-10-10
• 公開（公告）號(hào): CN103484424A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建民;陳存仙;董飛;王桂芝;張賽賽;秦孜娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法，包括以下步驟：

1）山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離和純化；

2）單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的制備；

3）單細(xì)胞克隆的制備；

其特征在于：

所述步驟2單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的制備，具體包括如下步驟：

a.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：配制體積比FBS：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10μg/L表皮生長(zhǎng)因子和10萬(wàn)IU/L青鏈霉素雙抗；

b.細(xì)胞培養(yǎng)基處理：

在進(jìn)行第四代傳代培養(yǎng)的時(shí)候，在細(xì)胞傳代24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換成上述全新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，離心除去雜質(zhì)、微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

c.單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的配制：將上述處理獲得的培養(yǎng)基與步驟a配制的細(xì)胞培養(yǎng)基等體積混合，再加入0.05倍體積的FBS，分裝后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

所述步驟3單細(xì)胞克隆的制備，具體步驟如下：

a.消化細(xì)胞：消化第四代山羊乳腺上皮細(xì)胞并吹打成單細(xì)胞懸液；

b.稀釋細(xì)胞懸液：移取20μL細(xì)胞懸液稀釋于含有5mL、37℃預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的60mm培養(yǎng)皿中，吹打均勻；

c.單細(xì)胞顯微操作：在40倍視野下用10μL微量移液器吸取單個(gè)細(xì)胞，接種于含有37℃預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的24孔板中；

上述a步驟中，所采用的消化方式為胰蛋白酶常規(guī)消化方式，采用常用的實(shí)驗(yàn)用0.25%胰蛋白酶、37℃、2-5分鐘即可完成；

d.傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)觀察并選取合適的單細(xì)胞克隆群落：

將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)記含有1-3個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔并補(bǔ)加500μL單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基；總共培養(yǎng)48-72小時(shí)后，在顯微鏡下用無(wú)菌槍頭剔除多余的細(xì)胞，使得選定的每孔含有一個(gè)細(xì)胞，更換單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)；以后每48小時(shí)更換一半培養(yǎng)基并觀察，4-5天后即可得到單細(xì)胞克隆群落。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法，其特征在于：所述步驟（1）山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離和純化主要包括以下步驟：

1）組織取樣：無(wú)菌采集山羊乳腺腺泡組織；

2）分離細(xì)胞：組織塊培養(yǎng)法分離乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；

3）純化細(xì)胞：差速消化法結(jié)合差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞即可得到純化的乳腺上皮細(xì)胞。