[發明專利]一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法

在審

• 申請號: 201310428463.3
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103487418A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 劉志洪;楊利;何夢媛;吳正俊;湯志愷;王宇輝
• 申請（專利權）人: 廣州陽普醫療科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C09K11/06
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

技術領域

本發明屬于上轉換熒光共振能量轉移檢測技術領域，具體涉及一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法。

背景技術

目前生物樣品中的生物分子的檢測方法主要有異相分析和均相分析兩種，現有的異相分析方法主要有酶聯免疫分析、化學發光免疫分析和放射性免疫分析等。其中酶聯免疫分析是在抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記的基礎上進行的分析，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成有色產物，通過產物的量與受檢物的關系進行定性或定量分析。現有的均相分析方法主要有時間分辨熒光免疫測定、下轉換熒光免疫和上轉換熒光共振能量轉移檢測。下轉換熒光共振能量轉移是一種基于供受體在距離足夠近時的偶極-偶極相互作用的非輻射躍遷過程，是一種均相檢測方法，可以克服異相分析所需的洗滌分離過程，操作簡單，目前已經被用于疾病相關的生物分子的檢測。時間分辨熒光免疫測定是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。上轉換熒光共振能量轉移利用上轉換熒光納米材料作為熒光共振能量轉移體系的供體材料的均相分析方法，可以克服生物樣品背景熒光的干擾，可用于復雜生物樣品的檢測，現有的基于上轉換熒光共振能量轉移的檢測方法所采用的受體材料主要有有機染料、金納米粒子。

但是這些方法都存在一定的缺陷：

（1）酶聯免疫分析是一種異相分析方法，需要洗滌分離過程，操作繁瑣、耗時，同時，酶聯免疫分析還需要使用抗原抗體等蛋白，價格昂貴，檢測成本高；

（2）下轉換熒光免疫可以克服異相分析需要洗滌分離的缺點，但是卻無法避免生物樣品的背景干擾和光散射，限制其在復雜血液樣本分析中的應用；

（3）時間分辨熒光免疫分析不僅可以克服異相分析分析需要洗滌分離的缺點，同時也可以避免生物樣品的背景干擾和光散射，可用于復雜血液樣本的分析檢測，但是時光分辨熒光免疫分析的儀器價格昂貴，檢測成本高；

（4）目前基于上轉換熒光共振能量轉移的檢測方法所使用的受體材料主要是有機染料、金納米粒子，其中有機染料作為猝滅劑時的猝滅能力較低，影響分析檢測的靈敏度；金納米粒子作為猝滅劑時需要進行表面標記。

發明內容

本發明克服現有技術的不足，提供一種以碳納米顆粒為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法。

一種以碳納米材料為受體的上轉換熒光共振能量轉移檢測方法，其特征在于以水溶性的上轉換熒光納米材料為熒光供體，以碳納米材料為熒光受體，按下列步驟操作：

（1）制備水溶性的上轉換熒光納米材料并在其表面標記單鏈核酸、多肽或蛋白，將帶有表面標記的上轉換熒光納米材料分散于緩沖液中，得到熒光供體溶液；

（2）制備碳納米材料，將碳納米材料分散于溶劑中，得到熒光受體溶液；

（3）將熒光供體溶液、熒光受體溶液和緩沖液按不同體積比混合后，得到熒光供體濃度相同、熒光受體濃度不同的各混合液，置于20～30℃孵育60～120min，在980nm激光器下測定各混合液的上轉換熒光強度，得到熒光猝滅效率最大的混合液中所對應的熒光供體濃度和熒光受體濃度；

（4）標準曲線繪制：取熒光供體濃度和熒光受體濃度分別為熒光猝滅效率最大時所對應的濃度的混合液7組，置于20～30℃孵育60～120min后，以其中一組混合液為空白樣，向其余各組混合液中分別加入已知濃度的目標物，再置于37℃孵育90～120min；在980nm激光器下測定各組混合液的上轉換熒光強度，空白樣的熒光強度為F₀，加入目標物的各組混合液的熒光強度為F，以（F-F₀）/F₀為縱坐標，目標物在混合液中的濃度為橫坐標，繪制標準曲線；

（5）取步驟（4）所述熒光供體濃度和熒光受體濃度分別為熒光猝滅效率最大時所對應的濃度的混合液，20～30℃孵育60～120min，加入未知濃度的目標物樣品，再置于37℃孵育90～120min后，測定混合液的熒光強度F_x，計算（F_x-F₀）/F₀的值，代入步驟（4）得到的標準曲線，再計算得到樣品中目標物的濃度。

上述方案中，所述水溶性上轉換熒光納米材料為粒徑30～100nm的球形納米材料，其表面修飾有氨基或羧基。