[發(fā)明專利]一種含易被氧化氨基酸的多肽的純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310416314.5
• 申請(qǐng)日: 2013-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN104447942A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙忠衛(wèi);劉建;馬亞平;袁建成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14
• 代理公司: 深圳市深佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44285
• 代理人: 唐華明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多肽純化領(lǐng)域，特別涉及一種含易被氧化氨基酸的多肽的純化方法。

背景技術(shù)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤。全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開始一直呈上升趨勢。乳腺癌中99%發(fā)生在女性，男性僅占1%。據(jù)國家癌癥中心和衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示：全國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發(fā)病率全國合計(jì)約為42.55/10萬，城市約為51.91/10萬，農(nóng)村約為23.12/10萬。目前乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。

常見的治療乳腺癌的藥物包括醋酸甲羥孕酮片、甲睪酮片、希羅達(dá)、倍美力、戈舍瑞林等。其中，戈舍瑞林是一種合成的十肽化合物，屬于促黃體生成素釋放激素的類似物，長期使用可抑制垂體的促黃體生成激素的分泌，從而引起女性血清雌二醇的下降，達(dá)到治療乳腺癌的作用。

戈舍瑞林肽序中具有色氨酸殘基，色氨酸極易被氧化而產(chǎn)生非常明顯的顏色，一般為紅色或紫紅色。采用固相合成法、液相合成法合成戈舍瑞林粗肽時(shí)，由于合成過程較為復(fù)雜，會(huì)用到多種縮合劑和催化劑，因此肽序中的色氨酸殘基易被氧化而使產(chǎn)品帶有紅色或紫紅色，影響戈舍瑞林藥物的質(zhì)量。其它的含有色氨酸等易被氧化氨基酸的多肽類藥物在合成時(shí)也會(huì)發(fā)生不同程度的氧化而使產(chǎn)品帶有顏色，因此在合成含有易被氧化氨基酸的多肽類藥物過程中，需要去除顏色以保證藥品的質(zhì)量。一般采用采用HPLC純化法和活性炭吸附法將氧化雜質(zhì)去除。在利用HPLC純化法去除顏色時(shí)，由于氧化并沒有使整個(gè)肽序列發(fā)生變化，其性質(zhì)與被氧化前差別很小，因此需要多次HPLC純化才能將顏色去除，導(dǎo)致產(chǎn)品的收率較低；在利用活性炭吸附法去除顏色時(shí)，由于活性炭的吸附作用不具備選擇性，在吸附顏色的同時(shí)，還會(huì)吸附目標(biāo)產(chǎn)物，一旦吸附上目標(biāo)產(chǎn)物就很難解離下來，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的收率偏低，這種情況對(duì)于分子量在2000以下的多肽尤為明顯。因此，提供一種既能有效去除多肽產(chǎn)品中的顏色，又能保證產(chǎn)品的收率較高的多肽純化方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種含易被氧化氨基酸的多肽的純化方法。該方法通過調(diào)整粗肽溶液的pH值至6.0～8.0，再加入還原劑，從而可去除粗肽溶液中的顏色，且提高了精肽的收率。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種含易被氧化氨基酸的多肽的純化方法，包括如下步驟：

獲得粗肽，經(jīng)前處理，得到第一粗肽溶液，經(jīng)第一調(diào)節(jié)pH值至6.0～8.0，得到第二粗肽溶液；

取第二粗肽溶液與還原劑混合，經(jīng)第二調(diào)節(jié)pH值至4.0～7.0。

還原劑選自含有巰基的有機(jī)酸，含有硫離子或硫氫離子的酸或無機(jī)鹽，含有還原性金屬離子的無機(jī)鹽，含有亞硫酸根或亞硫酸氫根的無機(jī)鹽，或二氧化硫；

易被氧化氨基酸為易發(fā)生氧化反應(yīng)的氨基酸。

多肽作為藥物，具有生理活性強(qiáng)、免疫原性低、療效高等諸多優(yōu)點(diǎn)，但多肽類物質(zhì)自身固有的特點(diǎn)如口服利用率較低、酶降解性高以及半衰期極短等，使其作為藥物的開發(fā)應(yīng)用受到諸多的局限。而導(dǎo)致多肽藥物不穩(wěn)定的一個(gè)重要原因就是含有易被氧化氨基酸的多肽極易被氧化。含有易被氧化氨基酸的多肽在合成過程中被氧化后會(huì)致使多肽帶有顏色，影響多肽產(chǎn)品的質(zhì)量，因此需要去除被氧化的多肽。本發(fā)明提供了一種利用還原劑的還原性質(zhì)去除被氧化的多肽的方法，并提供了還原劑的種類，還提供了被氧化的多肽與還原劑反應(yīng)時(shí)適宜的pH值范圍，本發(fā)明提供的純化方法可避免多肽被過度的還原，不會(huì)破壞多肽的結(jié)構(gòu)，保持了多肽原有的活性。為了避免多肽被過度的還原，多肽的結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，保持多肽原有的活性作用，作為優(yōu)選，還原劑選自含有巰基的有機(jī)酸，含有硫離子或硫氫離子的酸或無機(jī)鹽，含有還原性金屬離子的無機(jī)鹽，含有亞硫酸根或亞硫酸氫根的無機(jī)鹽，或二氧化硫。

不同種類的氨基酸穩(wěn)定性有很大差別，有些氨基酸含有易被氧化的結(jié)構(gòu)，在自然貯存條件下，容易發(fā)生氧化反應(yīng)，這些易被氧化的氨基酸包括色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等。

在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，含易被氧化氨基酸的多肽為含有色氨酸的多肽，但含易被氧化氨基酸的多肽并不局限于含有色氨酸的多肽，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的含易被氧化氨基酸的多肽均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。

在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，含易被氧化氨基酸的多肽為戈舍瑞林。