[發(fā)明專利]一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310413243.3
• 申請(qǐng)日: 2013-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN103487425A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林居強(qiáng);陳榮;馮尚源;陳冠楠;黃祖芳;俞允;陸鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/65
• 分類號(hào): G01N21/65
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊;吳欽緣

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種癌細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜判別方法，具體說是將癌細(xì)胞與具有SERS活性的納米材料用脈沖電場(chǎng)進(jìn)行預(yù)處理，檢測(cè)癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)，最后利用多變量分析技術(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和判別的方法。屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

拉曼光譜（Raman?spectroscopy）是一種基于拉曼散射效應(yīng)而發(fā)展起來的分子光譜技術(shù)，采用拉曼光譜技術(shù)可以從分子水平上探測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的蛋白、核酸、脂類以及糖類等生物分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)和信息。在腫瘤生長和發(fā)展過程中，上述分子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和數(shù)量會(huì)發(fā)生明顯變化，通過對(duì)比研究癌變和正常生物樣本（組織、細(xì)胞或相關(guān)生物分子）的拉曼光譜，從二者的差異可發(fā)現(xiàn)能反映癌變信息的特征光譜，從而可應(yīng)用于癌癥診斷研究。與常規(guī)檢測(cè)技術(shù)相比，拉曼光譜技術(shù)具有樣本預(yù)處理簡單、無損、快速等優(yōu)點(diǎn)，然而，拉曼光譜信號(hào)非常微弱（約為熒光的萬分之一），一些與癌癥相關(guān)的指紋信號(hào)易被熒光等背景噪聲所掩蓋。因此，如能對(duì)拉曼信號(hào)進(jìn)行增強(qiáng)，同時(shí)抑制熒光等背景信號(hào)，將顯著提高癌癥檢測(cè)的靈敏度。1974年，F(xiàn)leishmann等人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吡啶分子吸附在粗糙銀表面上，其拉曼散射信號(hào)比溶液中吡啶分子的拉曼散射信號(hào)增強(qiáng)約6個(gè)數(shù)量級(jí)，這種增強(qiáng)效應(yīng)被稱為表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface?enhanced?Raman?scattering，SERS）效應(yīng)，因此表面增強(qiáng)拉曼光譜可簡稱為SERS。最近發(fā)現(xiàn)具有SERS活性的銀納米粒子還能有效地猝滅熒光，進(jìn)一步提高了SERS檢測(cè)的靈敏度，目前SERS增強(qiáng)效應(yīng)最高可達(dá)到?10¹⁴-10¹⁵數(shù)量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了某種意義上可稱之為最高靈敏度的單分子檢測(cè)?。SERS技術(shù)保留了拉曼光譜的原有優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度通過SERS和熒光猝滅效應(yīng)得到顯著提高。當(dāng)前將SERS技術(shù)應(yīng)用于癌細(xì)胞檢測(cè)已成為國際上拉曼光譜領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。如能利用SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的判別，對(duì)癌癥的臨床診斷具有重要的意義。為了實(shí)現(xiàn)這一研究目標(biāo)，首先要解決以下兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。

第一，需發(fā)展一種快速的細(xì)胞SERS檢測(cè)方法，這是實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞大規(guī)模篩選的一個(gè)必要前提。第二，獲得的細(xì)胞SERS光譜要穩(wěn)定不能出現(xiàn)“閃爍”等現(xiàn)象，這是實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞判別的一個(gè)基本保障。然而，現(xiàn)有的癌細(xì)胞SERS檢測(cè)方法除有“閃爍”現(xiàn)象外，還存在耗時(shí)較長或操作繁復(fù)等問題，如直接孵育方法是一種利用細(xì)胞內(nèi)吞生理功能，即“被動(dòng)吸收”入具SERS活性的納米材料后實(shí)現(xiàn)細(xì)胞SERS檢測(cè)的方法，該方法耗時(shí)較長（>20小時(shí)）。免疫結(jié)合方法需要制備特異性的免疫SERS探針，即檢測(cè)不同種類癌細(xì)胞需要合成不同種類的免疫SERS探針，探針不具備通用性且成本較高。微注射方法操作繁復(fù)，難以實(shí)現(xiàn)批量癌細(xì)胞的SERS檢測(cè)。2009年，申請(qǐng)人首次提出一種電穿孔細(xì)胞SERS檢測(cè)方法，利用該方法能夠在30分鐘內(nèi)獲得癌細(xì)胞的SERS光譜，實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的快速SERS檢測(cè)。初步解決了第一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。

然而，和其他細(xì)胞SERS檢測(cè)方法一樣，利用電穿孔細(xì)胞SERS檢測(cè)方法獲得的細(xì)胞SERS光譜也同樣存在“閃爍”現(xiàn)象，即在一定的時(shí)間段內(nèi)，連續(xù)對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行多次SERS檢測(cè)，獲得的多個(gè)SERS光譜譜型在峰位、峰強(qiáng)及峰數(shù)上均出現(xiàn)較大的波動(dòng)。因此，第二個(gè)技術(shù)難點(diǎn)還有待解決。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提出一種利用電穿孔方法將具有SERS活性的納米材料快速導(dǎo)入癌細(xì)胞，結(jié)合超聲波等方法獲得穩(wěn)定、無閃爍的細(xì)胞SERS光譜，并采用多變量統(tǒng)計(jì)分析實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞判別的方法。該方法具有快速、易于操作、通用性好及成本低廉等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的癌細(xì)胞檢測(cè)，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

?

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：?

一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜判別癌細(xì)胞的方法，其特征在于，采用超聲波快速預(yù)處理冰浴條件下孵育的SERS活性納米材料和多種不同類型細(xì)胞后，利用電穿孔方法分別將SERS活性納米材料快速導(dǎo)入不同類型細(xì)胞內(nèi)部，利用拉曼光譜儀檢測(cè)獲取癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜，建立多種不同類型細(xì)胞表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)多變量統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行聚類分析，獲得正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)應(yīng)的判別散點(diǎn)分布圖，據(jù)此實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的判別。

所述的細(xì)胞是指市售的標(biāo)準(zhǔn)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。

所述的癌細(xì)胞為經(jīng)過體外培養(yǎng)并處于貼壁或懸浮狀的癌細(xì)胞。

所述的SERS活性納米材料是指銀溶膠或金溶膠。

該方法包括如下步驟：

（1）細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制備