[發(fā)明專利]導(dǎo)入hTERT重組子構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310403790.3
• 申請日: 2013-09-01
• 公開（公告）號: CN104419721A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 翁炳煥;羅玉琴;李曉;嚴(yán)愷;沈國松;黃荷鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C40B50/06;C40B40/02
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及導(dǎo)入hTERT(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)重組子或hTERT介導(dǎo)構(gòu)建巨核細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，主要用于血液病研究領(lǐng)域，為開展巨核細(xì)胞或與巨核細(xì)胞相關(guān)的各種研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

背景技術(shù)

巨核細(xì)胞是正常骨髓中的一種能生成血小板的成熟細(xì)胞。該細(xì)胞體積巨大，成熟的巨核細(xì)胞邊緣部分破裂脫落后形成血小板。巨核細(xì)胞按發(fā)育過程分為(1)原始巨核細(xì)胞：胞體較大，直徑15～30μm，圓形或不規(guī)則形。胞核較大，圓形，不規(guī)則，核染色質(zhì)呈粗大網(wǎng)狀，排列緊密，核仁2～3個。胞質(zhì)量較少，不均勻，邊緣不規(guī)則，染深藍(lán)色，無顆粒，核周著色淺淡。(2)幼稚巨核細(xì)胞：胞體明顯增大，直徑30～50μm，外形常不規(guī)則。胞核不規(guī)則，有重疊或扭轉(zhuǎn)，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀或小塊狀，排列緊密，核仁可有可無，胞質(zhì)量增多，染藍(lán)色或淺藍(lán)色，近核處呈淡藍(lán)色或淺粉紅色，出現(xiàn)少量天青胺藍(lán)顆粒。(3)顆粒型巨核細(xì)胞：胞體甚大，直徑40～70μm，有時可達(dá)100μm，其形態(tài)不規(guī)則。胞核較大，形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)較粗糙，排列緊密呈團(tuán)塊狀，無核仁，胞質(zhì)極豐富，染粉紅色，夾雜有藍(lán)色，質(zhì)內(nèi)含有大量細(xì)小的紫紅色顆粒，常聚集成簇，但無血小板形成。(4)產(chǎn)生血小板型巨核細(xì)胞：胞體巨大，直徑40～70μm，有時可達(dá)100μm，胞核不規(guī)則，高度分葉狀，核染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀。胞質(zhì)呈均勻粉紅色，質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的紫紅色顆粒或血小板。胞膜不清晰，多呈偽足狀，其內(nèi)側(cè)及外側(cè)常有血小板的堆集。(5)裸核型巨核細(xì)胞：產(chǎn)生血小板型巨核細(xì)胞的胞漿解體后，釋放出大量血小板，僅剩一胞核，稱之為裸核。

巨核細(xì)胞雖然在骨髓的造血細(xì)胞中為數(shù)最少，僅占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.05％，但其產(chǎn)生的血小板卻對機(jī)體的止血功能極為重要。每個巨核細(xì)胞均可產(chǎn)生1000-6000個血小板。產(chǎn)血小板的巨核細(xì)胞也是從骨髓中的造血干細(xì)胞分化發(fā)展而來的。造血干細(xì)胞首先分化生成巨核系祖細(xì)胞，也稱巨核系集落形成單位(colony?forming?unit-megakaryocyte，CFU-Meg)。祖細(xì)胞階段的細(xì)胞核內(nèi)的染色體一般是2-3倍體。當(dāng)祖細(xì)胞是2倍體或4倍體時，細(xì)胞具有增殖能力，因此這是巨核細(xì)胞系增加細(xì)胞數(shù)量的階段。當(dāng)巨核系祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為8-32倍體的巨核細(xì)胞時，胞質(zhì)開始分化，內(nèi)膜系統(tǒng)逐漸完備。最后有一種膜性物質(zhì)把巨核細(xì)胞的胞質(zhì)分隔成許多小區(qū)。當(dāng)每個小區(qū)被完全隔開時即成為血小板，一個個血小板通過靜脈竇竇壁內(nèi)皮間的空隙從巨核細(xì)胞脫落，進(jìn)入血流。

據(jù)目前的研究所知，巨核細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié)機(jī)制類似于紅細(xì)胞系生成的調(diào)節(jié)，至少受兩種調(diào)節(jié)因子分別對兩個分化階段進(jìn)行調(diào)節(jié)。這兩種調(diào)節(jié)因子是：巨核系集落刺激因子(Meg-CSF)和促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)。巨核系集落刺激因子是主要作用于祖細(xì)胞階段的調(diào)節(jié)因子，它的作用是調(diào)節(jié)巨核系祖細(xì)胞的增殖。骨髓中巨核細(xì)胞總數(shù)減少時促使該調(diào)節(jié)因子的生成增加，Meg-CSF是一種低分子糖蛋白，分子量約為46000，它與促血小板生成素具有完全不同的免疫學(xué)性質(zhì)。促血小板生成素也是一種糖蛋白，當(dāng)血流中血小板減少時，促血小板生成素在血液中的濃度即增加。該調(diào)節(jié)因子的作用包括：①增強(qiáng)祖細(xì)胞的DNA合成和增加細(xì)胞多倍體的倍數(shù)；②刺激巨核細(xì)胞合成蛋白質(zhì)；③增加巨核細(xì)胞的總數(shù)，結(jié)果增加了血小板的生成。根據(jù)去腎大鼠出現(xiàn)血小板減少時血液中促血小板生成素的濃度不增加的事實，推測腎可能是產(chǎn)生促血小板生成素的部位。

在某些不明原因或不明原因致上述調(diào)節(jié)紊亂的情況下，巨核細(xì)胞可出現(xiàn)(1)巨核細(xì)胞病態(tài)造血：如胞體、胞漿、胞核變小或畸型，功能障礙。(2)巨核細(xì)胞白血病：巨核細(xì)胞大量增殖而引起的惡性疾病。(3)巨核細(xì)胞成熟障礙：表現(xiàn)為外周血小板減少，骨髓巨核細(xì)胞成熟受阻。

為了在體外從細(xì)胞水平更進(jìn)一步研究巨核細(xì)胞的發(fā)育、功能、病理機(jī)制或影響因素，就需要有一種可在體外長期傳代培養(yǎng)的永生巨核細(xì)胞模型，但現(xiàn)在還沒有這種巨核細(xì)胞模型。

國外文獻(xiàn)報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin?DL、Kung?AL?和Sullivan?CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動物模型及人類和動物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制。