[發明專利]一種煙草疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法

無效

• 申請號: 201310402932.4
• 申請日: 2013-09-07
• 公開（公告）號: CN103555823A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 李本金;陳慶河;翁啟勇;何美玲;謝世勇;謝廷鑫
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種煙草疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于煙草疫霉菌高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間煙草黑脛病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。

背景技術

由煙草疫霉菌(Phytophthora?nicotianae?Breda?de?Haan)引起的煙草黑脛病是一種毀滅性世界病害。1896年van?Breda?de?Haan在印度尼西亞的爪哇首次發現，此后該病流行蔓延迅速，1922年便成為美國的佛羅里達、堪薩斯州煙區的嚴重病害。1924年后，該病己遍布于全世界溫帶、亞熱帶和熱帶地區煙田。中國于1950年首次報道，當時該病發生在黃淮煙區，目前各主要產煙區均有不同程度的發生，其中安徽、山東、河南為歷史上的重病區；云南、貴州、四川、湖南、廣東、廣西、福建等南方煙區發生亦相當普遍，平均發病率為5％-12％，嚴重田塊發病率高達75％，甚至造成絕收。煙草疫霉的寄主范圍很廣，可以侵害數百種植物，病害通常在潮濕、多雨條件下發病重，潛育期短，可多次再侵染，傳播與蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。近年來，由于我國連作煙田面積不斷擴大，連作年限不斷增加，加重了該病害的流行，我國平均每年因煙草黑脛病造成的經濟損失達1億元以上，僅次于煙草病毒病。該病屬于維管束系統性病害，一旦發生就很難控制，對煙草威脅極大，并常與其他煙草根莖部病害混合發生，給病害的診斷造成困難，而生產上則常因不明發病原因，難以有針對性的防治措施，故造成更為嚴重危害。因此建立煙草疫霉菌快速檢測體系，早期對發病植株及土壤進行疫霉菌快速準確檢測，對預測病害發生情況、及時采取有效的防治措施控制病原菌的傳播和流行、減少經濟損失都具有重要的理論和實際意義。

傳統煙草疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特性等，程序繁瑣，所需時間較長，鑒定時還易受人為及環境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢測出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期，而免疫血清學鑒定方法雖已建立，但是特異性較差，常常受到抗血清質量的影響，容易造成假陽性，因此這些方法的應用均受到一定的限制。

近年來隨著分子生物學技術的發展，以聚合酶鏈式反應（PCR）技術為代表的分子檢測方法得到了迅速的發展和應用，PCR技術的應用在很大程度上彌補了傳統方法的不足，這類方法普遍具有特異、靈敏、快速且不需要進行病原菌分離培養的特點，可用于煙草疫霉引起病害顯癥之前的早期監測。

利用核糖體轉錄間隔區（rDNA-ITS）基因序列在物種進化過程中的保守性和異變性設計引物進行PCR擴增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害檢測中得到了廣泛的應用。但是越來越多的研究發現，在疫霉屬中，部分疫霉菌種間ITS序列差異很小，以ITS為靶標設計的引物難以將這部分疫霉菌與其近緣種區分開，因此要對煙草疫霉菌進行高靈敏性和特異性檢測，應從疫霉菌其它基因上設計引物。已有的研究表明，疫霉菌屬中的YPT1基因（ras-related?protein）是一個與原癌基因Ras(Rat?sarcoma)相關的基因，在酵母中，該基因編碼一個與Ras相關的GTP結合蛋白。YPT1基因包含有多個外顯子和內含子，多個外顯子具有保守性，而這些內含子在不同種之間具有多變性，非常適合于設計引物進行疫霉屬卵菌近緣種的分子檢測，區分不同種的疫霉菌。Schena等分析了29個疫霉種43個菌株的YPT1基因的序列，認為YPT1基因作為疫霉菌分子檢測的靶標基因在理論上是可行的。

因此，可以通過測定煙草疫霉菌及其它疫霉菌的YPT1基因，并進行多重比對分析，來鑒定煙草疫霉菌。該檢測方法目前尚未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中煙草疫霉菌的生物學檢測方法特異性差，靈敏度低、所需周期長、免疫血清學鑒定方法容易造成假陽性的問題，提供煙草疫霉菌特異分子檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的煙草疫霉菌快速分子檢測的方法。

實現本發明的目的包括下列步驟：

1．通過測定煙草疫霉菌及其它疫霉菌的YPT1基因，并進行多重比對分析，設計了對煙草疫霉菌具有特異擴增作用的1對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物YhF:?5'-?GACATGATATCAACTGTTCTGCAG?-3'

下游引物YhR:?5'-?CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG?-3'

對煙草疫霉菌特異性擴增出342?bp的產物。