[發(fā)明專(zhuān)利]火木層孔菌中3’,4’-二羥基苯乙酮在抗禽流感H5N1病毒上的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310401648.5
• 申請(qǐng)日: 2013-09-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103816139A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙晨;宋愛(ài)榮;孔超;黃芳;梁大勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A61K31/12
• 分類(lèi)號(hào): A61K31/12;A61P31/16;C07C49/825;C07C45/79
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗禽流感病毒H5N1的火木層孔菌中活性物質(zhì)的提取制備方法，尤其涉及到的火木層孔菌菌株，已于2013?年8月26日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，?保藏編號(hào)為CGMCC?No.8108，生物樣品分類(lèi)名稱(chēng)為火木層孔菌?Phellinus?igniarius，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。?

背景技術(shù)

火木層孔菌，子實(shí)體無(wú)柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時(shí)常龜裂，無(wú)皮殼，初期有細(xì)微絨毛，后變無(wú)毛，有同心環(huán)棱，邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無(wú)子實(shí)層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì)，菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿(mǎn)白色菌絲，管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個(gè)，孢子近球形，光滑，無(wú)色，5-6*3-4微米，剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米，菌絲不分枝，無(wú)橫隔，直徑3-5微米。?

苯乙酮是一種無(wú)色晶體，或淺黃色油狀液體，有山楂的氣味。熔點(diǎn)20.5℃，沸點(diǎn)202.3℃，密度（20/4℃）1.0281g/cm3。微溶于水，易溶于多種有機(jī)溶劑。能與蒸氣一起揮發(fā)，氧化時(shí)可以生成苯甲酸；還原時(shí)可生成乙苯，完全加氫時(shí)生成乙基環(huán)己烷。用于制香皂和香煙，也用作纖維素酯和樹(shù)脂等的溶劑和塑料工業(yè)生產(chǎn)中的增塑劑等。可由苯與乙酸酐反應(yīng)制得，或由乙苯氧化制得，也可用乙酰氯與苯在三氯化鋁作用下經(jīng)傅氏反應(yīng)制得。?

????3',4'-二羥基苯乙酮的抗菌活性已經(jīng)被證實(shí)，如今，未見(jiàn)到有抗情流感病毒活性的報(bào)到。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開(kāi)了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的3',4'-二羥基苯乙酮。本發(fā)明首次公開(kāi)了3',4'-二羥基苯乙酮的一種新活性，測(cè)定了其對(duì)MDCK細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度，證明其具有抗禽流感H5N1病毒的作用。?

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：?

首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是：

玉米淀粉????1-5%?????????????葡萄糖??????1-5%

蛋白胨?????0.1-0.5%??????????酵母膏?????0.1-0.5%

硫酸鎂?????0.1-0.5%??????????磷酸二氫鉀?0.01-0.05%

(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20～35℃溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80～280r/min，pH?3～8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7～15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5～4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20～35℃，發(fā)酵罐壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH?3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7～15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。

(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；?

(4)用體積百分比為60～95%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60～90%，乙醇優(yōu)選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優(yōu)選為濃縮液體積的3-6倍；

(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50～70℃條件下，加熱1～2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)二級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。

然后從火木層孔菌粗提物中制備3',4'-二羥基苯乙酮，步驟如下：火木層孔菌粗提物→乙醇沉淀→正相硅膠層析→氯仿與甲醇梯度洗脫→TLC檢測(cè)→甲醇凝膠層析→TLC檢測(cè)→反相硅膠層析→TLC檢測(cè)→減壓蒸干→無(wú)色油狀物（3',4'-二羥基苯乙酮）。?

具體方法為：?

(1)制備火木層孔菌菌粗提物；

(2)將上述步驟（1）所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，置于通風(fēng)設(shè)備處干燥并攪拌；

(3)對(duì)上述步驟（2）后制備的原料進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2至5次，得到洗脫液；

(4)將步驟（3）中的最后一次洗脫液等體積硅膠拌樣，進(jìn)行硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；