[發明專利]利用銀耳菌體作為催化劑制備銀杏內酯B的方法

有效

• 申請號: 201310393204.1
• 申請日: 2013-09-02
• 公開（公告）號: CN103468760A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 張志才
• 申請（專利權）人: 張志才
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.利用銀耳菌體作為催化劑制備銀杏內酯B的方法，其特征在于以銀耳為出發菌株，通過試管斜面菌種、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、離心獲得菌體，菌體催化銀杏內酯合成含有銀杏內酯B的反應液，含有銀杏內酯B的反應液經過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復溶，-20℃結晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內酯B晶體。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的銀耳菌體菌種為從云南、山西和西藏的任意一種金耳子實體中分離出的金耳伴生菌菌種。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：銀耳菌種通過液體搖瓶、種子罐和菌體轉化銀杏內酯，分離提取得到銀杏內酯B。其中所述的液體搖瓶種子培養基組成為(單位為克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，加水至適當體積，起始pH值為5.0～8.0，100～140℃滅菌20～60分鐘；其中所述的種子罐培養基組成為(單位為克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，消泡劑0.1～0.8，加水至適當體積，起始pH值為5.0～8.0，100～140℃滅菌20～60分鐘；其中所述轉化銀杏內酯反應液組成為(單位為克／升)：銀杏內酯(包括銀杏內酯A、B、C和M)10～50，起始pH值為5.0～8.0；其中所述的搖瓶培養的培養條件是：250mL三角瓶裝液量為60～150mL，接種3～4塊4×4mm小塊菌種，置于溫度22～30℃，轉速120～160轉／分鐘，培養時間24～48小時；其中所述種子罐的培養條件是：接種量5～10％(種子液體積／接種后體積)，培養溫度22～30℃，攪拌速率90～150轉／分鐘，通風量1：0.3～1v／v／m，培養時間80～90小時；其中所述的轉化工藝條件是：種子液4000～6000轉／分鐘，離心5～20分鐘，收集菌體，菌體與反應液按1：5～50(重量：體積)混勻，在溫度22～30℃，攪拌速率90～150轉／分鐘，通風量1：0.3～1v／v／m，轉化6～18小時；按照該轉化工藝，其中在進行搖瓶培養之前，首先將銀耳菌體的斜面菌種接入新配制的馬鈴薯葡萄糖培養基中進行傳代培養，培養溫度22～30℃，培養時間24～248小時。

4.根據權利要求1所述的銀杏內酯B的方法，轉化液4000～6000轉／分鐘離心，濾液用鹽酸或硫酸調節pH1.0～4.0，連續用0.3～3倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20℃結晶24～120小時，過濾，濾渣水洗，80℃干燥得到銀杏內酯B純品。

5.根據權利要求1所述的轉化提取工藝所制得的銀杏內酯B白色，純度≥99％，銀杏內酯轉化率>90％。

6.一種銀杏內酯B的生產技術，其特征在于包括如下步驟：

在銀杏內酯(包括銀杏內酯A、B、C和M)加入蒸餾水和酸，調節pH6.0-7.0，配成20-30克銀杏內酯／升的反應液，將銀耳菌體和反應液按照重量／體積1：20-30混合，在溫度20-30℃，攪拌速率100-150轉／分鐘，反應10小時以上；

反應之后的反應液按照4000-6000轉／分鐘離心10-20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節pH2.0-3.0，連續用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20℃以下結晶70小時以上，過濾，濾渣水洗，干燥得到銀杏內酯B。