[發明專利]產生中內胚層細胞及多能游走細胞的方法與細胞群及用途

無效

• 申請號: 201310385240.3
• 申請日: 2008-01-30
• 公開（公告）號: CN103627671A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: S·道爾頓;D·雷諾茲
• 申請（專利權）人: 佐治亞大學研究基金會
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02;A61K35/12;A61K35/34;A61P9/10;A61P9/00
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 李婉婉;張苗

本申請為申請日為2008年1月30日、申請號為200880009636.5、名稱為“用于產生內胚層和中胚層細胞系及多能游走細胞（MMC）的早期中胚層細胞即穩定的中內胚層細胞群”的中國發明專利申請的分案申請。?

技術領域

本發明涉及由靈長類多能干細胞（pPSCs）（尤其是包括人胚胎干細胞（hESCs））產生早期中胚層細胞，以及中胚層細胞分化的新方法。所述這些方法可以產生關鍵的多能前體，該多能前體具有形成心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞系的潛能。這些方法可以用于包括BG01和BG02在內的所有的人胚胎干細胞（hESC）系。?

本發明還涉及能夠分化為中胚層或內胚層細胞系的穩定多能游走細胞（MMC）的產生。MMCs可以傳代至少20次（可能無限地），并可以經冷凍后復蘇、再擴增和分化為多種細胞系。產生所述這些細胞的方法針對從胚泡（blastocycts）產生多能細胞類型（MMC），從而不用經過典型的hESC狀態即可產生治療上有用的細胞類型。?

本發明還涉及從靈長類多能干細胞（pPSCs）（尤其是hESCs）產生中內胚層細胞的方法、產生定義的定形內胚層細胞的方法、產生多能游走細胞（MMCs）的方法、產生中胚層前體細胞（IMPs）的方法和心血管疾病的細胞治療。?

本申請要求2007年1月30日提交的在先申請US60/898,204和2007年9月19日提交的在先申請US60/994,354的優先權，這兩個申請都以其整體在此引入作為參考。?

背景技術

人胚胎干細胞（hESCs）（hESCs的標記包括SSEA3、SSEA4、TRA-1-60抗原、TRA-1-81抗原、Nanog、Oct4）為一種多能細胞群，能分化成衍生自所有三個胚層和胚外細胞系的細胞。hESC的此種特性使其在細胞治療（例如糖尿病、心臟病、神經退化性疾病）、藥物開發和建立發育模型方面具有重要的意義。?

在小鼠中已鑒定了其它的多能細胞類型。原始的外胚層樣（EPL;Rathjen等人,1999,J.Cell?Sci）細胞由mESC形成并具有去分化成為mESC的能力。最近，鑒定了一種新的小鼠細胞—植入后外胚層干細胞（EpiSC;Tesar等人,Nature448:196-202;2007），該細胞與hESC（Nanog+、Sox2+、Oct4+）具有相同的特性。所有這些小鼠的多能細胞類型能夠在體外或畸胎瘤測定中產生三個胚胎干細胞層。?

外胚層干細胞（EpiScs）和誘導的多能干細胞（iPS）符合廣義的多能細胞類別，并且在概念上，本申請描述的技術可以應用于這些和其它多能細胞類型（即靈長類多能細胞）。EpiSc外胚層干細胞從植入后早期的胚胎中分離，該細胞表達Oct4并具有多能性（Tesar等人,Nature,VoI448.p.19612July2007）。由成人皮膚成纖維細胞、或其它成體細胞通過反轉錄病毒轉導4個基因（c-myc、Klf4、Sox2、Oct4）而去分化變回多能狀態，形成誘導的多能干細胞（iPS細胞）（Takahashi和Yamanaka,Cell126,663-676,August25,2006）。?

發展其它非ESC的自我更新的多能干細胞將有助于改善發育模型，促進向成體細胞的定向分化，并且比傳統方法更有效且更經濟。?

附圖說明

圖1：在確定培養基中的基質膠（matrigel）上生長的BG02hESCs細胞?的放大倍數10×、20×、40×的明視場圖（bright?field?picture）。?

圖2：顯示了外胚層、中胚層、內胚層和胚外細胞系的可能的hESC細胞命運的示意圖。?

圖3：顯示了導致形成T+中內胚層細胞的分化途徑的示意圖，其中，所述T+中內胚層細胞可以進一步分化為中胚層細胞（Meso）或定形的內胚層細胞（DE）。?

圖4：顯示了在確定的培養基中并向BG01hESCs中加入Wnt3a的條件下中內胚層細胞的形成。（A）在加入Wnt3a（25ng/ml）后3天的時期內，對Nanog、T、Eomes和MixLl轉錄本的Q-PCR分析。（B）用Wnt3a（25ng/ml）處理細胞2天（48小時）時細胞的免疫染色，圖中柱狀板塊顯示未處理（hESCs）的和處理的（+Wnt3a）樣品中的E-鈣粘蛋白（cadherin）、Nanog、T、β-連環蛋白（catenin）和Snail的染色。?

圖5：顯示了在存在典型的Wnt信號及缺失TGFβ信號的條件下形成中內胚層細胞的模型。?