[發(fā)明專利]重組大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑及其制備方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310381832.8
• 申請日: 2013-08-28
• 公開（公告）號: CN103409360A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳新華;敖敬群;李艷霞
• 申請（專利權(quán)）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C07K14/81;C07K1/22;C12P21/02;A23L1/03;C12R1/19
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森;何加友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，尤其是涉及一種重組大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatins)是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸殘基的蛋白酶水解作用的抑制因子，對半胱氨酸類組織蛋白酶具有抑制作用(1.鄭常文，董長江，唐宏力等.豬血漿巰基蛋白酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)研究.四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1993,3:015)。

水產(chǎn)品加工，尤其是魚糜加工過程中殘留的半胱氨酸類組織蛋白酶在魚糜凝膠的加熱制備過程中會降解魚糜中的肌球蛋白，導(dǎo)致凝膠劣化(2.Olafsdottir?G,Martinsdóttir?E,et?al.Methods?to?evaluate?fish?freshness?in?research?and?industry.Trends?in?Food?Science&Technology,1997,8(8):258-265)，降低魚糜制品的品質(zhì)。造成魚糜凝膠劣化的半胱氨酸類組織蛋白酶主要有組織蛋白酶B、L、L-like以及與肌原纖維結(jié)合的絲氨酸蛋白酶（3.侯魯娜，陳學(xué)云，聶小華，劉璘.魚糜凝膠劣化相關(guān)組織蛋白酶的研究進(jìn)展.食品科技，2010，35：164-167）。目前，水產(chǎn)品加工行業(yè)中往往通過添加一些化學(xué)試劑或從豬、牛血漿及雞蛋清、馬鈴薯中制得的cystatin來抑制凝膠劣化，增強(qiáng)產(chǎn)品凝膠強(qiáng)度。抗凍劑、還原劑、氧化劑、凝膠增強(qiáng)劑等化學(xué)試劑的使用盡管在一定程度上可以幫助凝膠的形成并增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度，但不能從根本上解決由內(nèi)源性蛋白酶引起的凝膠劣化問題。從豬、牛血漿及雞蛋清、馬鈴薯中制得的cystatin價格昂貴，在加工過程中會使產(chǎn)品產(chǎn)生不良的風(fēng)味和色澤，且由于禽流感、瘋牛病的流行，使人們對含有這些來源的食品安全心存顧慮，因此迫切需要尋找新型、安全、高效、成本低廉的食品級cystatin。來源于魚類自身的cystatin可通過專性抑制魚類半胱氨酸類蛋白酶的活性有針對性地高效解決魚糜制品加工過程中的凝膠劣化問題，利用基因工程表達(dá)的重組魚類cystatin則可大大降低產(chǎn)品制備成本,在魚糜加工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21/pET-his-Lyccystatin?B。

本發(fā)明的第二目的在于提供重組大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?B及其制備方法。

本發(fā)明的第三目的在于提供重組大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?B在制備水產(chǎn)品加工添加劑中的應(yīng)用。

所述大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21/pET-his-Lyccystatin?B已于2013年5月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2013225，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。

所述重組大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?B（rLyccystatin）由表達(dá)大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?B基因的大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21/pET-his-Lyccystatin?B的重組表達(dá)產(chǎn)物制得，其理論分子量約11kDa。

所述重組大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?B的制備方法，包括如下步驟：

1）挑取大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21/pET-his-Lyccystatin?B單菌落在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，第二天按照1%的比例將此過夜培養(yǎng)物接種于100mL培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.4～0.6，加入誘導(dǎo)物IPTG（Isopropylβ-D-1-Thiogalctopyranoside，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至終濃度為0.1～1mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)后將培養(yǎng)物離心收集菌體，用結(jié)合緩沖液洗滌菌體3次后再用結(jié)合緩沖液重懸菌體，得結(jié)合緩沖液重懸的菌體溶液，所得樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE檢測大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑B基因的表達(dá)；

2）將步驟1）得到的結(jié)合緩沖液重懸的菌體溶液于冰浴中進(jìn)行超聲破碎，超聲后產(chǎn)物離心分離上清與沉淀分別制備樣品經(jīng)SDS-PAGE分析證實大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?B基因的表達(dá)產(chǎn)物大量存在于超聲后上清中，說明其在大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21/pET-his-Lyccystatin?B中得到可溶性表達(dá)；