[發明專利]枯草芽孢桿菌PCR檢測、鑒定特異引物對

無效

• 申請號: 201310377013.6
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103409549A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 曹鳳明;楊小紅;關大偉;馬明超;李俊;沈德龍;姜昕;馮瑞華;李力;陳慧君;葛一凡;趙金華;邴曉會
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體而言，提供了利用PCR技術快速檢測、鑒定枯草芽孢桿菌的引物對，適合于微生物肥料質檢機構、菌種鑒定機構應用。

背景技術

隨著農業的可持續發展和社會主義新農村建設力度的加大，微生物肥料在培肥地力、提高化肥利用率、修復土壤、促進農作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用、提高農產品品質等方面的作用受到更多的重視。近三十年我國微生物肥料行業發展迅速，產品種類不斷增加，而產品的核心-特定的微生物已達100多種。種類繁多的菌種拓展了微生物肥料的應用范圍，提高了作用效果，同時也給微生物肥料產品的質量監督和檢驗帶來了新的考驗。

枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)是微生物肥料中最常使用的菌種，與地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、、深褐(萎縮)芽孢桿菌(B.atrophaeus)、莫哈韋(莫杰夫)芽孢桿菌(B.mojavensis)、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(B.sonorensis)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)、暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)等芽孢桿菌同屬枯草群。枯草群菌株表型相似，很難快速準確區分，而傳統的檢測方法主要是以形態特征和生理生化特征為主，存在著檢驗周期長，操作繁瑣，費用高，準確性差等缺點。因此，迫切需要研究建立快速、準確、靈敏的檢測新方法，以滿足以枯草芽孢桿菌為有效菌的微生物肥料產品檢測的準確性和時效性。

PCR方法有著快速、準確和靈敏的特點，已廣泛用于食品安全、臨床醫學等領域：如對各種病毒和病源體-乙肝病毒、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病源菌已建立了PCR檢測方法；在微生物肥料領域也得到了應用，關大偉等人曾建立了的特異PCR法用于沼澤紅假單胞菌的鑒定和檢測，曹鳳明等人建立了一種鑒定微生物肥料中側孢短芽孢桿菌的特異PCR方法，都取得了良好的應用效果。這都表明了隨著技術的發展，分子生物學技術將在微生物檢測領域發揮著越來越重要的作用。為將PCR技術更廣泛應用于微生物肥料檢測和菌種鑒定領域，本發明人利用NCBI中Primer5.0(引物設計工具)，以Genbank數據庫中某個枯草芽孢桿菌的gyrA基因(解旋酶基因)為目標模板序列設計出一對枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)種特異性引物。并通過反復摸索實踐建立了基于PCR技術的、能夠快速、準確、靈敏地檢測微生物肥料中枯草芽孢桿菌的方法。該方法適用于枯草芽孢桿菌的檢測和鑒定。

發明內容

本發明內容的關鍵是提供用于檢測、鑒定枯草芽孢桿菌的特異引物對。另一內容是提供利用這對引物對待測菌株進行特異PCR擴增鑒定枯草芽孢桿菌的方法。

具體而言，本發明利用已公布的枯草芽孢桿菌gyrA基因核酸序列為目標模板序列，利用Primer5.0(引物設計工具)設計枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)種特異性引物，然后在Genbank數據庫中考察引物的特異性，再通過優化PCR反應中的鎂離子濃度和退火溫度等條件來提高PCR方法的特異性，并根據優化結果建立了枯草芽孢桿菌的特異PCR鑒定方法，用于微生物肥料中枯草芽孢桿菌的檢測和鑒定。

本發明用于檢測、鑒定枯草芽孢桿菌的引物對序列為：

上游引物(F)：5′-TCTGCTCGTGAACGGTGCT-3′；

下游引物(R)：5′-TTTCGCCTTATTTACTTGG-3′。

本發明用于鑒定枯草芽孢桿菌的PCR方法為：

PCR反應體系：

PCR擴增參數：

附圖說明

圖為應用枯草芽孢桿菌特異引物對標準菌株進行PCR的實驗結果(照片)如所示。其中，各泳道的具體說明如下：

泳道1：標準分子量：100bp標準分子量

泳道2：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?CCTCCAB92068)

泳道3：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?CGMCC1.1849)

泳道4：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?JCM2499)

泳道5：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?ACCC10242)

泳道6：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?ATCC29056)

泳道7：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis?ACCC11025)