[發明專利]一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶的內源活性檢測方法

無效

• 申請號: 201310375783.7
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103468801A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 唐其柱;卞洲艷;鄧偉;周恒;楊政;徐蔓;張潔鈺;廖海含
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/34
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

技術領域

????本發明涉及一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶的檢測方法，特別涉及一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶的內源活性檢測方法。

背景技術

目前用于檢測轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription?activator-like?effector?nucleases,?TALENs）活性的方法，有如下3種：?

靶點酶切檢測：該方法將TALEN質粒轉染細胞系（GFP質粒共轉染觀察轉染效率），提取轉染后細胞的基因組，通過聚合酶鏈式反應（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）擴增目的DNA，將PCR擴增的DNA片段經限制性酶切，凝膠電泳檢測，未打斷序列為敲除成功，計算灰度值與對照組相比。該方法的局限性為：（1）TALEN設計時必須已考慮將靶點選擇在有特異酶切位點的區域；（2）若FOLK酶剪切位點在酶切位點以外的部分，內切酶仍可發揮作用，檢測不到這樣的敲除，檢測敲除效率的結果比實際偏低。?

SURVEYOR突變檢測：該方法將TALEN質粒轉染細胞系（GFP質粒共轉染觀察轉染效率），提取轉染后細胞的基因組，通過PCR擴增目的DNA，將PCR擴增的DNA片段加入外源DNA后將混合物解鏈-退火，得到異源多聚DNA片段，用異源多聚檢測酶（SURVEYOR?Nuclease）按試劑盒步驟進行檢測，凝膠電泳顯示結果，分析結果得到敲除效率。該方法的局限性為：（1）對PCR產物要求高；（2）敲除效率取決于異源多聚DNA片段的形成比例，不能直接反應確切的敲除效率。

Luciferase?SSA檢測：首先在luciferase的編碼區中央插入一個終止子，?此時luciferase?沒有活性。將TALEN剪切的靶點位置序列插在終止子后，在TALEN的剪切作用下，靶點位置雙鏈斷裂，細胞通過同源重組方式修復DNA，終止子一并剪切掉，重組的luciferase具有活性。通過與參照的比值變化反應TALEN剪切的活性水平。該方法的局限性為：（1）只檢測了TALEN的外源性活性，未在特定種屬檢測其是否具有內源活性；（2）通過參照比較熒光素活性的高低，只能反映TALEN是否具有活性，而敲除效率的高低不能反映。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶的內源活性檢測方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶的內源活性檢測方法，包括如下步驟：針對所研究目的基因的外顯子序列設計靶位點，構建TALEN質粒對；將TALEN質粒對顯微注射至受精卵的原核或將TALEN質粒對體外轉錄為mRNA顯微注射至受精卵胞質內；將注射成功的受精卵體外培養；巢式PCR擴增培養得到的單個胚胎的目的基因；將經瓊脂糖凝膠電泳鑒定的PCR產物進行測序，根據測序套峰出現的比例判斷TALEN質粒的敲除效率，即可判斷TALEN質粒內源活性的高低。

所述的靶位點的設計優選為包括如下原則：（1）5’端固定堿基T；（2）從5’端起，第1位堿基不能為T，第2位堿基不能為A；（3）GC含量小于40%；(4)?3’端不能為G；（5）左、右臂靶位點16-19bp；（6）左右臂靶位點間隔18-24bp。

所述的受精卵優選為斑馬魚、大鼠、小鼠或猴等的受精卵。

所述的受精卵優選為通過如下方法獲取：雌性大鼠超數排卵后，頸椎脫臼處死，75%（v/v）酒精消毒后剪開腹腔，剪下輸卵管置于37℃預熱的M2液滴中，體式鏡下用尖鑷將輸卵管壺腹部劃開，釋放出卵丘-卵母細胞復合體；用透明質酸酶消化卵細胞周圍的顆粒細胞，M2洗3-5次后，移入覆蓋有礦物油的M16培養液中，置于37℃，5%的CO₂培養箱培養；取出卵細胞置于顯微鏡下觀察，選出可見清晰原核的受精卵用于顯微注射。

所述的顯微注射的方法優選為：安裝拉制好的持卵針，持卵針通過塑料管連接于裝有礦物油的帶微調的注射器，通過調節油泵控制卵的位置；安裝虹吸有質?；騧RNA的注射針，注射針通過塑料管連接有壓力泵的注射儀；根據注射針的出液量調節注射壓力，以可見胞質內有明顯膨脹而細胞仍能存活為適宜注射量。