[發(fā)明專利]用于檢測(cè)六價(jià)鉬離子的酶聯(lián)免疫試劑盒及其組建和檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310373273.6
• 申請(qǐng)日: 2013-08-25
• 公開（公告）號(hào): CN103412127A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張海棠;王自良;姜金慶;范國英;黃華國
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南科技學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種用于檢測(cè)六價(jià)鉬離子的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體，其特征在于：盒體內(nèi)設(shè)有用六價(jià)鉬離子包被抗原包被過的酶標(biāo)板、抗六價(jià)鉬離子單克隆抗體抗、酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、六價(jià)鉬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液、洗液濃縮液、樣品處理液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是：所述六價(jià)鉬離子包被抗原是由以下方法制備的：

取20?mL鉬酸與1mL濃度為10?mmol/L?pH值為8.0的HEPES緩沖液混合，得到Mo⁶⁺溶液；稱取10?mg?異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1mL?二甲基亞砜中，形成金屬螯合劑溶液；將Mo⁶⁺溶液和金屬螯合劑溶液混合，調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，25℃攪拌24h，轉(zhuǎn)速為1000?r/min，形成Mo⁶⁺-ITCBE螯合物的半抗原母液；稱取20?mg?載體蛋白OVA溶于1mL濃度為10?mmol/L、pH值為8.0的HEPES緩沖液中，形成載體蛋白溶液；取1mL?Mo⁶⁺-ITCBE螯合物半抗原母液，加入到1mL載體蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH值至9.0，室溫下1000?r/min攪拌24?h，然后移入透析袋中透析7?d天，收集透析液，制備出包被抗原Mo⁶⁺-ITCBE-OVA，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于：所述酶標(biāo)板按如下方法進(jìn)行包被：包被抗原為Mo⁶⁺-ITCBE-OVA，包被濃度為2?μg/mL，包被溶液為0.05?moL/L?pH?9.6的碳酸鹽緩沖液，包被劑量為100?μL/孔，37℃溫育2?h或室溫8?h，用洗液PBST洗滌3次，用5%的豬血清封閉，每孔250?μL，37℃溫育1?h，用洗液PBST洗滌3次；所述洗液PBST為0.01?mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液，其中含0.05%的Tween-20。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于：所述的抗六價(jià)鉬離子單克隆抗體是按以下方法制備的：

制備免疫抗原：取20?mL鉬酸與1mL濃度為10?mmol/L?pH值為8.0的HEPES緩沖液混合，得到Mo⁶⁺溶液；稱取10?mg?異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1mL?二甲基亞砜中，形成金屬螯合劑溶液；將Mo⁶⁺溶液和金屬螯合劑溶液混合，調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，25?℃攪拌24?h，轉(zhuǎn)速為1000?r/min，形成Mo⁶⁺-ITCBE螯合物的半抗原母液；稱取20?mg?載體蛋白BSA溶于1mL濃度為10?mmol/L、pH值為8.0的HEPES緩沖液中，形成載體蛋白溶液；取1mL?Mo⁶⁺-ITCBE螯合物半抗原母液，加入到1mL載體蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH值至9.0，室溫下1000?r/min攪拌24?h，然后移入透析袋中透析7?d，收集透析液，制備出免疫抗原Mo⁶⁺-ITCBE-BSA，－20℃凍存?zhèn)溆茫?/p>

免疫動(dòng)物：以Mo⁶⁺-ITCBE-BSA為免疫抗原，以Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為每只每次50～100?μg，首免用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑，首免后3周進(jìn)行第二次免疫，以后間隔2周免疫，共免疫5次；

選擇細(xì)胞融合備用小鼠：間接ELISA法檢測(cè)抗血清中Mo⁶⁺螯合物多克隆抗體的效價(jià)，阻斷ELISA法檢測(cè)Mo⁶⁺螯合物多克隆抗體對(duì)Mo⁶⁺-EDTA的半數(shù)抑制濃度IC₅₀，挑選效價(jià)最高、IC₅₀最低的小鼠，超免用于細(xì)胞融合；

制備陽性雜交瘤細(xì)胞：取NS0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過四次有限稀釋法亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗六價(jià)鉬離子的單克隆抗體的細(xì)胞株；

制備單克隆抗體：對(duì)經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株，采集腹水純化，獲得抗六價(jià)鉬離子的單克隆抗體。