[發明專利]檢測人PGI蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法

有效

• 申請號: 201310370229.X
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN104422773A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 朱建安
• 申請（專利權）人: 朱建安
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業平;張天舒

1.一種用于定量檢測待測物中人PGI蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過雙抗體夾心法檢測所述人PGI蛋白，其中：

所述雙抗體夾心法采用標記有熒光微球的第一PGI單克隆抗體作為捕獲抗體，所述第一PGI單克隆抗體來源于人PGI抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述雙抗體夾心法采用第二PGI單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二PGI單克隆抗體來源于人PGI抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；

所述人PGI抗原表位肽(1)和(2)分別為：

(1)Tyr-Lys-Val-Pro-Leu-Ile-Arg-Lys-Lys-Ser-Leu-Arg-Arg；

(2)Tyr-Lys-Asn-Phe-Thr-Val-Phe-Asp-Arg-Ala-Asn-Asn-Gln。

2.根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述第一PGI單克隆抗體是由第一PGI抗原制備而成的，該第一PGI抗原是通過使所述人PGI抗原表位肽(1)和(2)中的一者與載體蛋白偶聯制備而成的；并且

所述第二PGI單克隆抗體是由第二PGI抗原制備而成的，該第二PGI抗原是通過使所述人PGI抗原表位肽(1)和(2)中的另一者與載體蛋白偶聯制備而成的。

3.根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的粒徑為320nm至400nm。

4.根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球上的熒光物質為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明或X-羅丹明，其中優選為X-羅丹明；所述熒光微球的微球材料為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。

5.根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的激發波長為350～600nm，優選為390nm；發射波長為500～700nm，優選為615nm。

6.根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述試紙具有底板，并且在該底板上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設置有：樣品墊、結合墊、反應膜、吸水濾紙，所述結合墊包被有所述的標記有熒光微球的第一PGI單克隆抗體，所述反應膜包括檢測區和質控區，所述檢測區包被有所述第二PGI單克隆抗體，所述質控區包被有能與所述的標記有熒光微球的第一PGI單克隆抗體特異性結合的抗抗體。

7.根據權利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述反應膜為在大于550nm的波長下基本上不發熒光的硝酸纖維素膜。

8.根據權利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述底板基本上不具有熒光性質。

9.根據權利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述抗抗體為羊抗鼠IgG單克隆抗體或兔抗鼠IgG單克隆抗體，其中優選為羊抗鼠IgG單克隆抗體。

10.一種制備根據權利要求1至9中任意一項所述的熒光免疫層析試紙的方法，其包括以下步驟：

1）提供標記有熒光微球的第一PGI單克隆抗體；

2）提供結合墊，其中在所述結合墊上包被所述的標記有熒光微球的第一PGI單克隆抗體；

3）提供反應膜，其中在所述反應膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二PGI單克隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測區和質控區；和

4）在底板上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設置樣品墊、所述結合墊、所述反應膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述步驟1）包括：

a）用碳二亞胺活化熒光微球，優選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散液經超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球；

b）洗滌步驟a）所獲得的活化的熒光微球，優選地，將步驟a）所獲得的活化的熒光微球用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經超聲波處理；

c）用步驟b）所獲得的熒光微球標記第一PGI單克隆抗體，優選地，將步驟b）所獲得的熒光微球與第一PGI單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐溫水溶液分散，經超聲波處理，從而得到標記有熒光微球的第一PGI單克隆抗體。

12.根據權利要求10所述的方法，其中在所述步驟2）中，所述的標記有熒光微球的第一PGI單克隆抗體的包被濃度為0.5～2mg/ml。

13.根據權利要求10所述的方法，其中在所述步驟3）中，所述檢測區和所述質控區間隔3mm至8mm，所述第二PGI單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0.5～2mg/ml。