[發明專利]JEV優勢抗原表位E1-402aa重組質粒的制備方法及疫苗

無效

• 申請號: 201310362712.3
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103409454A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 徐志文;趙勤;朱玲;李鳳琴;劉驍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學;四川高金食品股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種JEV優勢抗原表位E_1-402aa重組質粒的制備方法及疫苗，用于乙型腦炎的防治。

背景技術

乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒，是流行性乙型腦炎的病原體，屬于黃病毒科。乙腦是嚴重威脅人畜健康的一種急性傳染病，患者病死率高，并可造成嚴重的神經系統后遺癥。JEV病毒的流行有嚴格的季節性，主要在夏秋季流行，屬于自然疫源性疾病，病毒通常在蚊→豬→蚊等多種動物間循環，是一種寄生宿主很廣的病毒，在八十年代就有大熊貓患乙型腦炎的研究。我國除西部少數省、自治區外，大部分地區都有JEV的流行。

乙型腦炎病毒核酸為單股正鏈RNA，含11000個堿基，只有一個開放閱讀框，能通過轉錄、翻譯、切割成多種結構蛋白和非結構蛋白，其3種結構蛋白為囊膜蛋白E、膜蛋白M和衣殼蛋白C，7種非結構蛋白為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。而能在保護性免疫及防治病毒感染起著重要作用的是E結構蛋白。白細胞介素7是一種機體調節免疫功能的細胞因子，能通過多種環節促進T細胞的增殖、活化，并能刺激MHC?II類抗原等多種細胞表面分子的表達和多種細胞因子的產生，且已被廣泛應用于DNA疫苗佐劑的研究中。

近年來，因為核酸疫苗能誘導機體產生廣泛的免疫反應，使得核酸疫苗受到了很多學者的關注。并且核酸疫苗更便宜，更安全，更易于工業生產。而乙型腦炎疫苗也有了大量的關于核酸疫苗的研究。

McCown等將乙腦的E和NS1重組桿狀病毒，用重組后的病毒接種細胞，然后免疫小鼠。結果表明，可以合成E蛋白和NS1蛋白的免疫組能有70％保護力，而只可以表達NS1蛋白的免疫組卻不能產生保護力。

Konishi等用含prM和E蛋白的重組質粒pcDNA-JE-ME免疫小鼠，二免后用致死量的乙腦攻毒，小鼠存活率100％，且保護能力能保持半年。

Lorenz等構建了一個攜帶JEV?M蛋白C末端的15氨基酸的E基因重組質粒，這15個氨基酸殘基能作為E蛋白的信號肽，用重組的質粒免疫小鼠。結果表明，該疫苗能刺激小鼠產生較高的JEV特異性中和抗體，并能抵抗致死量的乙腦病毒攻毒，但滴度略低于乙腦弱毒苗。說明在prM的幫助下，E蛋白能正確折疊和組裝。而Chen等去掉了prM基因，結果疫苗誘導的中和抗體滴度相對較低。

Chang等人將編碼JEV?prM和E蛋白基因重組質粒免疫小鼠，結果表明，能疫苗能刺激動物產生中和抗體，并能抵制致死量乙腦病毒的攻擊。

Lin等將含有JEV囊膜蛋白基因prM和非結構蛋白基因NS1的質粒DNA肌肉注射到小鼠體內。結果表明，免疫prM質粒的小鼠，有70％的保護率；而免疫NS1質粒的小鼠保護率為90％，空載體pcDNA3.1也有40％的保護率，說明了空載體有非特異性免疫佐劑作用。NS1質粒不能刺激產生中和抗體，但能刺激疫苗免疫和補體反應。但是，當NS1和NS2A蛋白N端的60個氨基酸同時免疫小鼠后卻不能提供有效的保護。推測NS1蛋白加上NS2A蛋白N端的60個氨基酸后使細胞表面的NS1蛋白的含量降低了。

吳玉水等構建了三種乙型腦炎的新型疫苗，DNA疫苗、E蛋白病毒樣顆粒疫苗和DNA疫苗。分別免疫小鼠后。結果表明，這三種新型疫苗都能誘發小鼠產生相應的JEV特異性中和抗體。

Kaur等構建了乙型腦炎prM和E基因的重組質粒，分別以基因槍和肌肉注射的方式免疫小鼠，劑量分別為1μg／只和100μg／只。結果表明，肌肉注射方式的質粒誘導抗E蛋白的抗體滴度顯著高于基因槍免疫組。但兩種質粒都可以誘導動物產生特異性JEV中和抗體。質粒免疫的方法不同，效果也有差異。可能因為肌肉注射與基因槍相比，肌肉注射的重組質粒明顯高于基因槍的質粒的含量。

非結構蛋白也是很重要的研究內容，Lin等構建了乙腦NS1蛋白的重組質粒，免疫小鼠后，能產生一定的保護力。Chen等構建了含有NS2A蛋白N端60個氨基酸的NS1的核酸疫苗，免疫后的小鼠不能抵御致死量病毒的攻毒。分析得出，單獨表達的NS1蛋白能產生二聚體分泌到細胞外，但加上了60個氨基酸的NS1不能使NS1蛋白分泌到細胞外。

現在對核酸疫苗的研究主要從目的基因的選擇和質粒載體的優化，加入免疫佐劑等方面來完善核酸疫苗。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種JEV優勢抗原表位E_1-402aa重組質粒的制備方法及疫苗。

本發明的技術方案如下：