[發(fā)明專利]JEV優(yōu)勢(shì)抗原表位E1-402aa重組質(zhì)粒的制備方法及疫苗

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310362712.3
• 申請(qǐng)日: 2013-08-16
• 公開（公告）號(hào): CN103409454A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐志文;趙勤;朱玲;李鳳琴;劉驍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué);四川高金食品股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/66;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種JEV優(yōu)勢(shì)抗原表位E_1-402aa重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

A1JEV優(yōu)勢(shì)抗原E_1-402aa的PCR克隆；

A11E_1-402aa基因的引物設(shè)計(jì)及合成；

根據(jù)NCBI上公布的乙腦病毒SA14-14-2毒株基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增該片段的引物：

P1：GAATTCCGGGATCCGGGTCAATGTTTAATTGTCTGGGAATGGGCAATCGTG.

P2：GTCGACTTACGTGCTTCCAGCTTTGTGCCAATG；

A12乙腦病毒RNA的提取

A13E_1-402aa基因的擴(kuò)增

A131mRNA的反轉(zhuǎn)錄

A132E_1-402aa基因的PCR擴(kuò)增

以P1、P2為引物，擴(kuò)增E_1-402aa基因，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃40s，55℃40sec,72℃40s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min；

A14E_1-402aa基因的回收；

A2pMD-E_1-402aa質(zhì)粒的構(gòu)建；

A21感受態(tài)細(xì)胞的制備；

A22連接和轉(zhuǎn)化；

取pMD19-T載體和回收的E_1-402aa的cDNA，于16℃連接過夜；

A23pMD-E_1-402aa重組質(zhì)粒的鑒定；

A3pCI-E_1-402aa真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；

A31E_1-402aa基因片段的酶切回收；

用EcoRI和SalI對(duì)pMD-E_1-402aa進(jìn)行雙酶切；

A32pCI-neo載體的酶切回收；

用EcoRI和SalI對(duì)pCI-neo進(jìn)行雙酶切；

A33連接與轉(zhuǎn)化；

取酶切回收的pCI-neo片段和酶切回收的E_1-402aa目的基因，于16℃連接過夜；

A34重組質(zhì)粒的鑒定；

將轉(zhuǎn)化好的菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，小量提取質(zhì)粒，用EcoRI和SalI對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用1％的瓊脂糖凝膠電泳；酶切鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確質(zhì)粒命名為pCI-E_1-402aa。

2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述JEV優(yōu)勢(shì)抗原表位E_1-402aa重組質(zhì)粒制備的JEV優(yōu)勢(shì)抗原表位E_1-402aa核酸疫苗。