[發(fā)明專利]一種酵母表達(dá)重組蛋白發(fā)酵液的固液分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310357544.9
• 申請日: 2013-08-15
• 公開（公告）號(hào): CN104370999A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁光軍;項(xiàng)煒;孫九如;李冬
• 申請（專利權(quán)）人: 上海萬特醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/36
• 分類號(hào): C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K14/765
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種酵母表達(dá)重組蛋白發(fā)酵液的固液分離方法。

背景技術(shù)

自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)作為宿主表達(dá)外源蛋白以來，作為一種新的高效的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母越來越引起人們的重視。巴斯德畢赤酵母有很好的發(fā)酵基礎(chǔ)，菌體密度可達(dá)100g/L干重。其生長培養(yǎng)液的組分包括無機(jī)鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉價(jià)而無毒。它能在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中快速生長，其中醇氧化酶AOX-甲醇代謝途徑的關(guān)鍵酶可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源的培養(yǎng)細(xì)胞中則檢測不到AOX。AOX的合成是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的。其基因啟動(dòng)子具有明顯的調(diào)控功能，可用于調(diào)控外源基因的表達(dá)。外源基因在甲醇以外的碳源中處于非表達(dá)狀態(tài)，而在培養(yǎng)液中加入甲醇后，外源基因即被誘導(dǎo)表達(dá)。巴斯德畢赤酵母中存在著一種稱為微體的細(xì)胞器，其中大量合成過氧化物酶，因此也稱為過氧化物酶體。合成的蛋白質(zhì)貯存于微體中，可免受蛋白酶的降解，且不對細(xì)胞產(chǎn)生毒害。

人血白蛋白，英文名為“Human?Albumin”，該藥一直有“生命制品”、“救命藥”之稱。是臨床急救的一種特殊藥品。一般人體的白蛋白正常值在每100ml血液中含有3.8～4.8克，如果比正常值低很多時(shí)就需要用人血白蛋白。這種藥臨床上用量很大，一般重癥病人都需要，正常人體內(nèi)可生成白蛋白，但病人則需要注射白蛋白來幫助康復(fù)。一般的慢性病人白蛋白值都會(huì)低一些，比如慢性肝病、慢性腎病、腫瘤等，缺乏白蛋白人就容易出現(xiàn)浮腫。人血白蛋白可以增加血容量和維持血漿膠體滲透壓，主要調(diào)節(jié)組織與血管之間水分的動(dòng)態(tài)平衡。由于白蛋白分子量較高，與鹽類及水分相比，透過膜內(nèi)速度較慢，使白蛋白的膠體滲透壓與毛細(xì)管的靜力壓抗衡，以此維持正常與恒定的血容量；同時(shí)在血循環(huán)中，1g白蛋白可保留18ml水，每5g白蛋白保留循環(huán)內(nèi)水分的能力約相當(dāng)于100ml血漿或200ml全血的功能，從而起到增加循環(huán)血容量和維持血漿膠體滲透壓的作用。白蛋白能結(jié)合陰離子也能結(jié)合陽離子，可以輸送不同的物質(zhì)，也可以將有毒物質(zhì)輸送到解毒器官。組織蛋白和血漿蛋白可互相轉(zhuǎn)化，在氮代謝障礙時(shí)，白蛋白可作為氮源為組織提供營養(yǎng)。

本專利的發(fā)明人應(yīng)用分子重組技術(shù)，在畢赤酵母(Pichia?pastoris)中表達(dá)了人血清白蛋白，表達(dá)量在每升10克以上，酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中所占體積為45%左右；發(fā)酵規(guī)模也達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的水平。然而，不同于小規(guī)模試驗(yàn)，當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化畢赤發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，由于絕大多數(shù)車間或是沒有采用或是沒有針對大規(guī)模畢赤發(fā)酵產(chǎn)物的大型專業(yè)特效離心機(jī)，或是常規(guī)工業(yè)級(jí)離心機(jī)的離心力無法達(dá)到高效分離的要求，要針對大量發(fā)酵液進(jìn)行快速固液分離具有相當(dāng)大的難度，僅通過常規(guī)離心機(jī)無法實(shí)現(xiàn)快速分離，這成了高效生產(chǎn)的最大瓶頸。

綜上，本領(lǐng)域有必要進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化酵母細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的固液分離方法，提高得率，避免浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種酵母表達(dá)重組蛋白發(fā)酵液的固液分離方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種酵母表達(dá)重組蛋白發(fā)酵液的固液分離方法，所述方法包括：

(1)在發(fā)酵液中加入沉淀劑和助凝劑進(jìn)行前處理；和

(2)將經(jīng)過步驟(1)處理的發(fā)酵液加入到膜過濾系統(tǒng)中，分離獲得發(fā)酵上清液。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的沉淀劑包括：氯化鋁、硫酸鋁鉀、硅酸鈉、硫酸鐵、聚丙烯酸鈉或硅藻土；和/或

所述的助凝劑包括：聚丙烯酰胺。

在另一優(yōu)選例中，所述的硅酸鈉、氯化鋁或硫酸鋁鉀的終濃度按照質(zhì)量體積比為0.01-10%；較佳地為0.2-2%；更佳地為0.5%。

在另一優(yōu)選例中，所述的聚丙烯酰胺的終濃度按照質(zhì)量體積比為0.01-1%；較佳地為0.03-0.5%；更佳地為0.05%。

在另一優(yōu)選例中，所述的膜過濾系統(tǒng)包括：陶瓷膜或聚偏氟乙烯膜(有機(jī)PVDF膜)。

在另一優(yōu)選例中，所述的陶瓷膜孔徑為0.05-0.5微米；較佳地為0.08-0.2微米；更佳地為0.1微米。

在另一優(yōu)選例中，所述的聚偏氟乙烯膜截留分子量大小為30-300KD；較佳地為80-130KD；更佳地為100KD；或所述的聚偏氟乙烯膜孔徑為0.05-0.2μm；較佳地0.08-0.15μm；更佳地0.1μm。