[發明專利]來源于產酸克雷伯氏菌的核糖醇脫氫酶（RDH）及其編碼基因與應用

無效

• 申請號: 201310354387.6
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103397006A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 朱玥明;孫媛霞;李泓漪;韓文佳;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/18;C12R1/22
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.來源于保藏編號CGMCC?No.7662的產酸克雷伯氏菌（Klebsiella?oxytoca）G4A4的核糖醇脫氫酶（RDH），是下述氨基酸殘基序列之一：

1）序列表中的SEQ?ID?NO：1；

2）將序列表中SEQ?ID?NO：1的氨基酸殘基序列經過氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有核糖醇脫氫酶作用的蛋白質，新蛋白質與SEQ?ID?NO：1同源性達到80％或更高。

2.編碼權利要求1所述核糖醇脫氫酶的基因（RDH），是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ?ID?NO：2的DNA序列；

2）編碼序列表中SEQ?ID?NO：1的DNA序列；

3）所編碼的序列80％或以上同源于序列表中SEQ?ID?NO：1且具有核糖醇脫氫酶作用的核苷酸序列；

4）在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ?ID?NO：2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

3.含有權利要求2所述基因的表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。

4.一種表達權利要求1所述核糖醇脫氫酶（RDH）的方法，包括以下步驟：

1）獲得核糖醇脫氫酶基因（RDH）：以所述產酸克雷伯氏菌（Klebsiella?oxytoca）G4A4的基因組DNA為模板，在序列表中序列3表示的引物1和序列表中序列4表示的引物2的引導下PCR擴增核糖醇脫氫酶基因（RDH）；

2）構建重組表達載體：將核糖醇脫氫酶基因（RDH）連接入表達載體中；

3）表達核糖醇脫氫酶（RDH）：將核糖醇脫氫酶基因（RDH）或含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組表達載體轉化或轉導宿主細胞及其后代細胞，發酵重組宿主細胞，使核糖醇脫氫酶基因（RDH）獲得表達，得到核糖醇脫氫酶（RDH）。

5.根據權利要求4所述的表達方法，其特征在于：所述步驟2）中用于構建含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組表達載體的出發載體可為pET系列載體，如pET-21a、pET-28a、pET-32a、pET-43a或pETDuet-1等等，優選為pET-21a；所述含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組表達載體的構建方法可為：將核糖醇脫氫酶基因（RDH）用限制性內切酶BamH?I和Hind?Ⅲ進行雙酶切后與經同樣酶雙酶切的出發載體在T4DNA連接酶作用下進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒，經測序鑒定出轉化有含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組表達載體的陽性轉化子，提取質粒，得到含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組表達載體。

6.根據權利要求5所述的表達方法，其特征在于：以pET-21a為出發載體構建的含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組表達載體命名為pETKRDH。

7.根據權利要求4或5或6所述的表達方法，其特征在于：所述步驟3）中的宿主為任一可表達外源基因的原核細胞；所述原核細胞可為大腸肝菌，如E.coli?BL21、E.coli?Rosetta、E.coli?Origami、E.coli?M15、E.coli?JM109或E.coli?LG90等，優選為E.coli?BL21；培養含有本發明核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組宿主細胞的培養基為低糖高氮適于大腸桿菌生長的培養基，如LB培養基、SOC培養基或肉湯培養基等，優選為LB培養基；當宿主為大腸肝菌時，需加入乳糖、IPTG或兩者混合物進行誘導表達，其中，所加入IPTG的濃度為0.1mM-0.5mM，優選為0.5mM。

8.根據權利要求4-7任一項所述的表達方法，其特征在于：所述步驟3）中含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組宿主細胞的發酵培養方法為：將含有核糖醇脫氫酶基因（RDH）的重組宿主細胞接種于50mL?LB培養基（含100μg/mL氨芐青霉素）中進行活化，然后按1％的接種量接種于1L?LB培養基（含100μg/mL氨芐青霉素）中，37℃、200rpm條件下進行培養，培養至OD₆₀₀=0.6-1.0時，加入0.1mM-0.5mM（優選為0.5mM）IPTG誘導物，在20℃、100rpm條件下誘導培養16-24h。