[發明專利]植物表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201310354203.6
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103397051A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 曲延英;陳全家;王希東;孟靈真;孫國清
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種植物表達載體，其特征在于，所述載體包含：

第一表達盒；

第二表達盒，所述第二表達盒與所述第一表達盒相連，位于所述第一表達盒的下游；以及

第三表達盒，所述第三表達盒分別與所述第一表達盒和所述第二表達盒相連，位于所述第二表達盒的下游以及所述第一表達盒的上游，

其中，

所述第一表達盒包含：

第一核酸分子，所述第一核酸分子為Bt基因；

第一啟動子，所述第一啟動子為CaMV35S啟動子，與所述第一核酸分子相連，位于所述第一核酸分子的上游，用于啟動所述第一核酸分子表達；以及

第一終止子，所述第一終止子為NOS終止子，與所述第一核酸分子相連，位于所述第一核酸分子的下游，用于終止所述第一核酸分子表達，

所述第二表達盒包含：

第二核酸分子，所述第二核酸分子為bar基因；

第二啟動子，所述第二啟動子為CaMV35S啟動子，與所述第二核酸分子相連，位于所述第二核酸分子的上游，用于啟動所述第二核酸分子表達；以及

第二終止子，所述第二終止子為NOS終止子，與所述第二核酸分子相連，位于所述第二核酸分子的下游，用于終止所述第二核酸分子表達，

所述第三表達盒包含：

第三核酸分子，所述第三核酸分子為NPT?II基因；

第三啟動子，所述第三啟動子為NOS啟動子，與所述第三核酸分子相連，位于所述第三核酸分子的上游，用于啟動所述第三核酸分子表達；以及

第三終止子，所述第三終止子為NOS終止子，與所述第三核酸分子相連，位于所述第三核酸分子的下游，用于終止所述第三核酸分子表達。

2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述第二表達盒中進一步包含第四核酸分子，所述第四核酸分子為gus?A基因，位于所述第二核酸分子和所述第二終止子之間。

3.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述第二核酸分子為Bt-4AB，具有SEQ?ID?NO：1所示的核酸序列。

4.一種用于制備抗除草劑及抗蟲轉基因植物的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1-3任一項所述的載體。

5.權利要求1-3任一項所述的載體，權利要求4所述的試劑盒在制備抗除草劑及抗蟲轉基因植物中的用途。

6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于，所述植物為棉花。

7.一種構建權利要求1-3任一項所述的植物表達載體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將bar基因連接至PMD18-T載體上，以便獲得PMD18-T-bar載體；

利用限制性內切酶XbaⅠ和BamHⅠ對所述PMD-18T-bar載體進行雙酶切，并純化回收小片段；

利用限制性內切酶XbaⅠ和BamHⅠ對pBI121空載體進行雙酶切，并純化回收大片段；

將所述小片段連接至所述大片段上，以便獲得pBI121-bar載體；

利用限制性內切酶Hand?III對所述pBI121-bar載體進行單酶切，并純化回收pBI121-bar載體大片段；

利用限制性內切酶Hand?III對Bt-4AB進行雙酶切，并純化回收Bt-4AB小片段；以及

將所述Bt-4AB小片段連接至所述pBI121-bar載體大片段上，以便獲得pBI121-bar/Bt載體，所述pBI121-bar/Bt載體即為權利要求1-3任一項所述的植物表達載體。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，按照4:1的體積比，將所述bar基因與所述PMD18-T載體混合，進行過夜連接，以便將所述bar基因連接至所述PMD18-T載體上，

任選地，利用T4DNA連接酶，按照摩爾比1：3的比例，將所述小片段連接至所述大片段上。

9.一種制備抗除草劑及抗蟲轉基因植物的方法，其特征在于，

利用權利要求1-3任一項所述的植物表達載體轉化受體植物，

任選地，進一步包括：

將所述植物表達載體轉化農桿菌LBA4404；以及

利用經過轉化的農桿菌LBA4404的菌液侵染所述受體植物，

任選地，所述植物為棉花，優選海島棉，更優選新海14，

任選地，所述受體植物呈愈傷組織的形式。

10.一種抗除草劑及抗蟲轉基因植物，其是通過權利要求9所述的方法制備的。