[發明專利]一種用于淋巴細胞培養的培養基及應用

有效

• 申請號: 201310349694.5
• 申請日: 2013-08-12
• 公開（公告）號: CN103409370A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 惠長野;李智民;張文;高朝賢;陳郁筠;黃先青;陳鈺婷;張健杰
• 申請（專利權）人: 深圳市職業病防治院
• 主分類號: C12N5/0781
• 分類號: C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種用于淋巴細胞培養的培養基及應用。

背景技術

體外淋巴細胞培養不僅是細胞遺傳學的傳統研究方法，還是自體細胞免疫療法這些新興技術實現的基礎。

為了模擬淋巴細胞體內的生長環境，培養基除維持生理滲透壓及pH值外，需要添加細胞生長所需的各類營養因子，如無機鹽、碳水化合物、氨基酸、維生素、微量元素等。動物血清的添加一直是淋巴細胞體外培養所必需的，比較常用的是胎牛血清和新生牛血清，血清在傳統淋巴細胞培養方法中起著重要作用，除有營養加富的作用外，更重要的是含有細胞生長所必須的生長因子、激素及某些痕量營養物質。培養基是淋巴細胞各種代謝產物的排放場所，血清中的組分（如血清蛋白），可作為代謝毒物清除劑使培養細胞免于過氧化損傷。使用動物血清的缺點如下：動物血清批次間質量不穩定；引入異種蛋白及抗細胞抗體抑制淋巴細胞的功能；用于細胞免疫療法時，有傳播疾病的潛在風險，異種蛋白增加過敏反應發生的機率。

鑒于動物血清的弊端，近年來出現了無血清培養基，通過額外添加細胞因子、激素、抗氧化劑等替代血清的作用，并涌現了適于各類細胞培養的商品化無血清培養基，但高昂的售價限制了其廣泛應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于淋巴細胞培養的培養基及應用。

本發明提供的用于淋巴細胞培養的培養基，包括基礎培養基、混合脫氧單核苷酸和人血漿。

脫氧核苷酸是細胞基因組DNA的重要組成成分，包括嘌呤和嘧啶核苷酸兩大類。淋巴細胞從頭合成核酸的能力有限，而且從頭合成消耗大量氨基酸及能量，在細胞快速生長的情況下，內源合成的核苷酸不足以滿足自身需求。人外周血淋巴細胞正常情況下處于G₀期，體外培養時，在有絲分裂原刺激下，轉化為淋巴母細胞并進行有絲分裂，蛋白質及DNA合成活躍。通過額外添加混合單核苷酸，模擬補救合成途徑，可促進DNA復制，提高淋巴細胞轉化效率。所述混合脫氧單核苷酸具體可為5’-AMP、5’-CMP、5’-GMP和5’-TMP的混合物。所述混合脫氧單核苷酸中的每種核苷酸在所述培養基中的濃度為5-50mmol/L，優選為5-20mmol/L。

人血漿與人血清的主要區別是血清中不含纖維蛋白原等凝血因子，人血漿蛋白質濃度比人血清蛋白質濃度高約0.2～0.5g/dL，其差異主要就是纖維蛋白原。人血漿白蛋白為胎牛血清的1.5-1.9倍，球蛋白為胎牛血清的3.3-4.1倍，高蛋白含量的人血漿賦予了培養基更強的pH緩沖及保護培養細胞的能力。人血漿是外周血淋巴細胞的天然培養基，除富含細胞生長所需的基本營養物質外，更重要的是含有促細胞生長的各種激素和生長因子、負責轉運功能的結合蛋白、有保護培養細胞功能的抗蛋白酶成分等，這些都是有化學限定的無血清培養基及血清替代物所無法比擬的。人源血漿的添加，使培養環境更接近人體內環境，解決動物血清批次間質量不穩定影響培養的問題。本發明提供的培養基可廣泛用于細胞遺傳學研究所需的外周血淋巴細胞培養，人源血漿可以良好地支持淋巴細胞體外生長，外源核苷酸作為條件營養素的添加促進DNA合成及細胞有絲分裂。所述人血漿在所述培養基中的體積百分含量可為5-30%，優選為10-20%或20-30%，如10-15%、15-20%、20-25%或25-30%。所述人血漿具體可為人外周血血漿。所述人血漿具體可為AB型人血的血漿。

所述培養基中還可包括抗凝劑（如肝素鈉）、有絲分裂原（如植物血凝素）和抗生素（如慶大霉素）。所述培養基具體可由所述基礎培養基、所述混合脫氧單核苷酸、所述人血漿、所述抗凝劑、所述有絲分裂原和所述抗生素組成。所述抗凝劑在所述用于淋巴細胞培養的培養基中的濃度可為50-70IU/mL（如60IU/mL），所述有絲分裂原在所述用于淋巴細胞培養的培養基中的濃度可為150-170μg/mL（如160μg/mL），所述抗生素在所述用于淋巴細胞培養的培養基中的濃度可為0.05-0.15mg/mL（如0.1mg/mL）。