[發(fā)明專利]由種公牛體外受精率對種公牛精子體內(nèi)受胎率的評價方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310347058.9
• 申請日: 2013-08-10
• 公開（公告）號: CN103392670A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李喜和;蘇杰;韓紅梅;王春生;吳冬生;胡樹香
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種由種公牛體外受精率對種公牛受胎率的評價方法，其特征在于：它包括如下步驟：

一、配制試劑：

按照牛卵母細(xì)胞撿卵液、牛卵母細(xì)胞成熟液、牛體外受精液BO-A、BO-B、BO-AB、牛體外受精培養(yǎng)液Stock?A、Stock?B、Stock?C、Stock?D、StockX、Stock?Y、Stock?Z、IVC?SOF液的次序排列；

（1）配制牛卵母細(xì)胞撿卵液：

H-M199（GIBCO，12340）+10%FBS

4℃保存，使用期限為一個月;

（2）配置牛卵母細(xì)胞成熟液:

M199(GIBICO,11150)+1μg/mlE2+0.1IU/mlFSH+1IU/mlLH+10%FBS

4℃保存，使用期限為一個月;

（3）配制牛體外受精液BO：

4℃保存，使用期限為一個月;

（4）配制牛體外受精液BO-A：

現(xiàn)配現(xiàn)用;

（5）配制牛體外受精液BO-B：

現(xiàn)配現(xiàn)用;

（6）配制牛體外受精液BO-AB：

等量BO-A與BO-B混合；

現(xiàn)配現(xiàn)用;

（7）配制牛體外受精培養(yǎng)液Stock?A：

4℃保存，使用期限為一個月;

（8）配制牛體外受精培養(yǎng)液Stock?B：

4℃保存，使用期限為一個月;

（9）配制牛體外受精培養(yǎng)液Stock?C：

4℃保存，使用期限為一個月;

（10）配制牛體外受精培養(yǎng)液Stock?D：

4℃保存，使用期限為一個月;

（11）配制牛體外受精培養(yǎng)液Stock?X：

4℃保存，使用期限為一個月;

（12）配制牛體外受精培養(yǎng)液Stock?Y：

4℃保存，使用期限為一個月;

（13）配制牛體外受精培養(yǎng)液Stock?Z：

4℃保存，使用期限為一個月;

（14）配制牛體外受精培養(yǎng)液IVC?SOF液：

SOF液體總體積10mlstockA1mlstockB1mlstockC100μlstockD100μlstockX100μlstockY100μlstockZ100μlNEAA100μlEAA200μlBSA0.08gP/S10μl酚紅10μl超純水7.18ml

4℃保存，使用期限為一個月;

二、體外受精：

（1）牛卵細(xì)胞的成熟培養(yǎng)：

①屠宰3h之內(nèi)的新鮮牛卵巢用無菌生理鹽水沖洗3次并浸泡在干凈的生理鹽水中,用20ml注射器17^#針頭抽取直徑在2-8mm的卵泡，將采集后的卵泡液放在10cm培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下?lián)斐雎亚?卵母細(xì)胞復(fù)合體COCs；

②把牛卵母細(xì)胞撿卵液與牛卵母細(xì)胞成熟液分別放在38.5℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡1h以上，然后將揀出的COCs用平衡好的牛卵母細(xì)胞撿卵液洗一遍，牛卵母細(xì)胞成熟液洗兩遍后，取一四孔板，每孔先加入500μl牛卵母細(xì)胞成熟液，再加入500μl石蠟油，按照每孔50-120枚的數(shù)目放入牛卵母細(xì)胞成熟液中，在38.5℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行成熟培養(yǎng)22h；

（2）體外受精：

①取50ml燒杯兩個，分別標(biāo)記為A和B：A配制牛體外受精液BO-A，B配制牛體外受精液BO-B；將配置好的牛體外受精液BO-A使用0.2μm過濾器過濾到新的50ml燒杯中，配好的牛體外受精液BO-B使用0.2μm過濾器過濾到新的50ml燒杯中，均放入37.5℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱；

②取牛原精1000萬，加入預(yù)熱的牛體外受精液BO-A5ml，將精子輕輕混勻后，2000rpm/min室溫離心5min，棄上清；再加入5ml預(yù)熱的牛體外受精液BO-A輕輕混勻后，2000rpm/min離心5min，棄掉上清后，用預(yù)熱的牛體外受精液BO-AB將牛精子濃度稀釋為1000萬/ml；

③將②處理好的精液在35mm皿中做100μl的精子滴，做好后加入石蠟油放入培養(yǎng)箱中；

④打開顯微鏡保溫板升至37.5℃，在顯微鏡下揀出步驟2（1）②成熟22h的牛卵細(xì)胞，在預(yù)熱的牛體外受精液BO-AB中洗3次，將③中做好的精子滴從培養(yǎng)箱中拿出，每個精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h；

（3）受精卵的體外發(fā)育培養(yǎng)：

經(jīng)步驟2（2）④受精6h后，用培養(yǎng)箱中預(yù)熱的IVCSOF液脫掉顆粒細(xì)胞，然后，把脫掉顆粒細(xì)胞的卵子放入預(yù)熱的每孔含500μlIVCSOF液上蓋500μl石蠟油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；　

（4）體外卵裂率檢測：受精48小時統(tǒng)計卵裂率；

卵裂率=正常卵裂的胚胎/用于受精的卵子數(shù)；

三、人工輸精：

（1）母牛的選擇：

A、青年牛16-18月齡、體重275-350Kg；

B、經(jīng)產(chǎn)牛產(chǎn)后60-90天、子宮復(fù)舊良好；發(fā)情規(guī)律、產(chǎn)后第二次自然發(fā)情時輸精;

（2）精液的選擇：

按照國家標(biāo)準(zhǔn)，選取解凍后精子活力大于30%，畸形率小于20%，每毫升精液中細(xì)菌菌落數(shù)小于1000個，頂體完整率大于40%，37℃存活時間大于4小時的種公牛細(xì)管冷凍精液；

（3）母牛發(fā)情鑒定：

A、外部觀察法：主要是根據(jù)母牛的外部和精神狀態(tài)來判斷發(fā)情的狀況;

B、陰道檢查法：用陰道開張器觀察陰道的黏膜、分泌物和子宮頸口的變化來判斷母牛的發(fā)情狀況;

C、直腸檢查法：主要是檢查卵巢的卵泡發(fā)育情況;

（4）凍精的解凍與人工輸精：

輸精時間和母牛排卵時間為發(fā)情結(jié)束后6-12小時，越接近越好；

（5）種公牛受胎率統(tǒng)計：輸精60天后檢測母牛是否懷孕

受胎率=懷孕母牛頭數(shù)/輸精母牛總頭數(shù)

四、種公牛體外受精卵裂率與人工授精受胎率關(guān)聯(lián)性比較評價標(biāo)準(zhǔn)

評價標(biāo)準(zhǔn)分級體外受精卵裂率范圍人工授精受胎率評價范圍145%—60%40±5%260%—80%50±5%3＞80%60±5%