[發(fā)明專利]用于生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310345823.3
• 申請(qǐng)日: 2013-08-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104342412B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁雪峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/225
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進(jìn)

本發(fā)明涉及一種酮還原酶突變體，其源于開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮還原酶，能將4?氯乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化生成(S)?4?氯?3?羥基丁酸乙酯，具有A94S，F(xiàn)147V，L199P，A202V中的一個(gè)或多個(gè)突變。本發(fā)明的酮還原酶突變體具有明顯的高比酶活，比野生型酮還原酶提高了2?20倍，利用該酶可生物催化將4?氯乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化生成(S)?4?氯?3?羥基丁酸乙酯；反應(yīng)條件溫和，對(duì)設(shè)備要求低，生產(chǎn)過(guò)程無(wú)需高溫或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效，專一的選擇性，故以此法生產(chǎn)他汀類藥物關(guān)鍵中間體(S)?4?氯?3?羥基丁酸乙酯無(wú)副產(chǎn)物產(chǎn)生，純化方便；此外反應(yīng)絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環(huán)保。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酮還原酶突變體及其在他汀類藥物中間體生產(chǎn)中的應(yīng)用，特別涉及一種源于開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的酮還原酶突變體及其在手性(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

阿托伐他汀鈣（商品名LIPITOR由輝瑞公司銷售）、羅蘇伐他汀鈣（商品名CRESTOR由阿斯利康公司銷售）以及匹伐他汀（商標(biāo)名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本銷售），是重要的降膽固醇他汀類藥物。而手性(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯是這些重要的他汀類藥物的關(guān)鍵的手性中間體。國(guó)內(nèi)2009年該中間體的產(chǎn)量為400噸，預(yù)計(jì)未來(lái)幾年內(nèi)，國(guó)內(nèi)產(chǎn)量將達(dá)到1000噸以上，直接經(jīng)濟(jì)效益在數(shù)億元。在已知的制備這些手性中間體的諸多途徑中，包括化學(xué)法和酶法，都具有很多缺點(diǎn)。由于化學(xué)法合成過(guò)程條件苛刻，副反應(yīng)多，產(chǎn)品分離純化難度大，得率低，成本高，使其難以成為用于商品規(guī)模合成的理想方法。采用酶法制備及手性(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯需要使用具有立體選擇性的酮還原酶，但現(xiàn)有的野生型酮還原酶催化活性很較低，使用10g/L粗酶粉 20小時(shí)僅可轉(zhuǎn)化 1g/L的酮底物，也使其難以成為用于商品規(guī)模合成的理想方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種酶催化活性高的酮還原酶及其制備方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)中天然存在的野生型酮還原酶，能將4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)轉(zhuǎn)化為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)。本公開(kāi)內(nèi)容的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)包括在一定位置突變的酮還原酶與開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)產(chǎn)生的野生型酮還原酶 (SEQ ID NO：2)相比表現(xiàn)出增加的催化活性。“野生型酮還原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型 KRED酮還原酶”指由源自開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮還原酶基因SEQ ID NO：1編碼的，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酮還原酶。該酶可將4-氯乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。“野生型”指與自然中所發(fā)現(xiàn)的一樣的材料或物質(zhì)的形式。例如野生型的蛋白質(zhì)或核酸序列是可以從自然界中的分離并且未經(jīng)過(guò)人為修飾的，在生物體中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在體外或體內(nèi)試驗(yàn)中所測(cè)量的與野生型酮還原酶相比，表現(xiàn)出使底物 (例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向產(chǎn)物 (例如S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯)轉(zhuǎn)化率增加的酮還原酶。

本發(fā)明提供的用于生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的酮還原酶突變體，其特征在于，其是源于開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)的野生型酮還原酶，其中，突變是在親本酮還原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在親本酮還原酶的氨基酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端添加或刪除1個(gè)或多個(gè)氨基酸，且與使用親本酮還原酶相比，其酮還原酶活性增強(qiáng)2-20倍。

進(jìn)一步地，所述突變體具有下述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三聯(lián)體表示：字母-數(shù)字-字母，其中數(shù)字表示突變氨基酸的位置，數(shù)字前的字母對(duì)應(yīng)突變?cè)O(shè)計(jì)的氨基酸，數(shù)字后的字母表示用于置換數(shù)字前氨基酸的氨基酸：A94S， F147V，L199P，A202V。