[發(fā)明專利]亞麻脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310344833.5
• 申請(qǐng)日: 2013-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN103451205A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李光鵬;左永春;魏著英;扈廷茂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/63;C12N15/85
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的基因工程技術(shù)，具體涉及一種亞麻脂肪酸脫氫酶基因密碼子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

脂肪酸(fatty?acid)是指一端含有一個(gè)羧基的長(zhǎng)的脂肪族碳?xì)滏湥嗖伙柡椭舅?Polyunsaturated?fatty?acids：PUFAs)含有超過(guò)一個(gè)(C＝C)，碳骨架大于18個(gè)碳原子的脂肪酸，是組成人體必需的物質(zhì)，對(duì)人體健康非常重要。根據(jù)雙鍵的位置不同，將多不飽和脂肪酸分為：ω-6PUFAs和ω-3PUFAs。ω-6PUFAs包括γ-亞麻酸(γ-LA)、花生四烯酸(AA)、亞油酸(18∶2n-6)等。ω-3PUFAs包括α-亞麻酸(α-LA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。ω-3去飽和酶基因能夠把ω-6PUAFs轉(zhuǎn)化為ω-3PUAFs，對(duì)生物體脂肪酸代謝起到關(guān)鍵作用，包括fat1、FAD3、FAD7、FAD8等，雙鍵引入的位置在第15-16個(gè)碳原子之間，又可將此類酶稱為△15去飽和酶。由于植物中ω-3PUFAs含量異常的高，說(shuō)明ω-3脂肪酸去飽和酶在植物中的活性相當(dāng)高；而哺乳動(dòng)物體內(nèi)缺乏ω-3脂肪酸去飽和酶，自身不能催化合成ω-3PUFAs，所以將植物的ω-3脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)到哺乳動(dòng)物中，也許可以得到活性更高的ω-3脂肪酸去飽和酶，更加有效的將ω-6PUFAs轉(zhuǎn)化為ω-3PUFAs。將ω-3脂肪酸去飽和酶基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，亞油酸(18∶2n-6)轉(zhuǎn)化為亞麻酸(18∶3n-3)，豐富的亞麻酸(18∶3n-3)可以在哺乳動(dòng)物自身的去飽和、鏈延長(zhǎng)酶的作用下合成EPA(20∶5n-3)和DHA(22∶6n-3)；進(jìn)而提高ω-3PUFAs的整體水平。

2009年，日本Kazuhiro?Saeki研究小組克隆了紅亞麻(scarlet?flax)的FAD3B基因，通過(guò)人源化改造的FAD3B基因轉(zhuǎn)染牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞后進(jìn)行成脂誘導(dǎo)；發(fā)現(xiàn)hFAD3轉(zhuǎn)基因脂肪細(xì)胞系中亞麻酸(18∶3n-3)(增幅0.3％)、DPA(22∶5n-3)(增幅1.5％)與DHA(22∶6n-3)(增幅2.1％)的水平明顯增加，亞油酸(18∶2n-6)水平顯著下降3％，)-6與ω-3PUFAs比值由2.6最低降至1.57；并且由對(duì)照組細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆形成的胚胎無(wú)形態(tài)學(xué)上的差異，并且克隆的囊胚率相同。

以上研究說(shuō)明，植物源性的去飽和酶基因在動(dòng)物體內(nèi)是可以發(fā)揮去飽和酶活性改變脂肪酸的組成，而且沒(méi)有表現(xiàn)出影響機(jī)體正常生理功能的征兆。然而，植物源性的基因通常難以在哺乳動(dòng)物中表達(dá)并發(fā)揮作用，因此如何對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，使得其能夠在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮作用是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問(wèn)題，在進(jìn)行密碼子優(yōu)化過(guò)程中面臨諸多挑戰(zhàn)：首先是如何獲得能夠表達(dá)的基因序列，其次，考慮外源基因mRNA的穩(wěn)定性和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯效率的影響，優(yōu)化的同時(shí)一定要避免阻礙表達(dá)的特殊的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。上述挑戰(zhàn)阻礙了對(duì)基因序列的優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的亞麻脂肪酸脫氫酶基因，所述基因包含SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列或者與其互補(bǔ)的核苷酸序列。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的亞麻脂肪酸脫氫酶基因還包括酶切位點(diǎn)，所述的酶切位點(diǎn)位于sEQ?ID?NO.1的核苷酸序列或者與其互補(bǔ)的核苷酸序列的兩，優(yōu)選的，所述的酶切位點(diǎn)分別是ECOR1和BamH1。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及含有上述亞麻脂肪酸脫氫酶基因的表達(dá)載體。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及上述載體在制備轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的載體用于哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中降低ω-6與ω-3的比值。

具體實(shí)施方式

一、FAD3基因人源化片段的合成